人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状比较论文

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1、人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状比较论文张菲斐，韩战营，邱春光，杨海波，黄振文，陈庆华，李凌，赵洛沙【摘要】目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（EPC）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点.方法：密度梯度离心法获得单个核细胞.freela公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（EGM2MVSingleQuots）和I型胶原酶为BectonDickinson公司产品；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiIAcLDL）购自AbDSerotec公司；vNC）.用Hanks洗涤MNCs3次，重悬于EGM2，调整细

2、胞计数2×109/L，接种于100mg/L纤连蛋白包被的24孔培养板中.另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30cm，PBS冲洗脐静脉腔，I型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min.收集消化液、离心、洗涤，EGM2调整细胞计数2×109/L，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC）用于实验.1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点，应用序列黏附法去除淋巴细胞的混杂.每例血样在分离出MNC并接种后每隔2h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入EGM2静止培养，4d后换

3、液.此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验.1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用PBS洗涤2次，2.5g/L胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，密度为1×109/L.每份细胞悬液取150μL×2分装2个试管，分别加入FITICD14，FITCCD146，FITCKDR，PECD34及同型对照mAb各20μL，避光反应30min，PBS洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次.上机后收集20000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示.1.2.2内皮细胞v2配置浓度为2g/L的I型胶原溶液，100g/L碳酸氢钠滴定溶

4、液pH值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100μL，37℃放置30min使其成胶.分别将2~3代贴壁的EPC和HUVEC制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况.1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11ol/LHEPES,100mL/L胎牛血清、300mL/LEGM2制备浓度为3g/L的胶原溶液.将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢SC细胞胶原溶液1mL.将裸鼠置于饲养笼28℃条件下30~60min，触摸裸鼠移植部位皮丘呈胶冻感为移植成功，然后常规条件饲养.21~30d处死裸鼠，取出移植体行病理切片分析

5、.统计学处理：采用SPSS11.0统计软件进行分析.计量数据以x±s表示，两组均数间的比较采用t检验，以P0.05为有统计学差异.2结果MNC接种后7~11d可见有簇状聚集的早期克隆出现，中间是圆形细胞，周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞（图1A）.持续培养至21~28d可观察到晚期克隆的出现，细胞均呈多角形或纺锤形，紧密贴壁，聚集向外生长（图1B）.至35~42d，可见细胞增殖、逐渐汇合成片，呈现内皮细胞典型的“铺路石”外貌（图1C,D）.HUVEC接种当时为圆形、悬浮，24h后细胞即伸展、贴壁，呈梭形或多角形（图2A），5~7d后贴壁细胞基本汇合成单层，外观与EPC来源细胞相同（图2

6、B,C）.2.1EPCs与HUVECs表型特征对比HUVEC相比，EPC表达高水平的干/祖细胞标记CD34和KDR（P0.01，图3）.单核细胞特异抗原CD14在两组细胞表面仅有微量表达，而泛内皮细胞标记CD146在两组细胞均为高表达但无统计学差异.v,SchneiderMD.Unchainmyheart:Thescientificfoundationsofcardiacrepair［J］.JClinInvest,2005,115(3):572-583.［3］BoosCJ,LipGYH,BlannAD.Circulatingendothelialcellsincardiovasculard

7、isease［J］.JAmCollCardiol,2006,48(8):1538-1547.［4］YoderMC,MeadLE,PraterD,etal.Redefiningendothelialprogenitorcellsanalysisandhematopoieticstem/progenitorcellprincipals［J］.Blood,2007,109(5):1801-1809.［5］DimmelerS.C