靶向survivin利用rna干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株ytmlc凋亡的初步研究

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1、靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究作者：蒋鸿超，孙茂盛，赵丹，吕琳，孙强明，李鸿钧【摘要】　　目的检测云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞内源凋亡抑制因子survivin基因的表达以及促进YTMLC细胞凋亡的情况。方法构建和转染重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2至YTMLC细胞株,通过免疫荧光和半定量RTPCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化，并通过流式细胞仪使用PIAnnexinV双染法检测YTMLC细胞株的

2、凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE1和pshRNAnegative非特异对照质粒;通过半定量RTPCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为80.60%和70.09%;通过PIAnnexinV双染法检测YTMLC细胞的凋

3、亡分别达（33.42±2.42）%（P<0.01）和（20.09±1.32）%（P<0.01）。结论重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。【关键词】siRNA　云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC　survivin基因;质粒;表达　Keyouscarcinomacells(YTMLC);survivingene;Plas

4、mid;Expression　　0引言survivin是一类仅在肿瘤细胞中表达的凋亡抑制因子(Inhibitorofapoptosis,IAP),在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[1]。研究表明,抑制survivin基因的表达可介导肿瘤细胞的凋亡,进而抑制肿瘤的生长[2]。本实验选择和设计针对survivin编码基因的siRNA靶序列,通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列的载体，并转染云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞,观察siRNA能否诱导肿瘤细胞内源性survivin表达的沉默并介导肿瘤细胞的凋亡增加,为肿瘤的

5、基因沉寂疗法提供实验基础。1材料和方法1.1材料与试剂1.1.1质粒、菌株和细胞siRNA表达质粒pGE1和非特异对照质粒pshRNAnegative购自Stratagene公司;大肠杆菌SCS1购自Stratagene公司。云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞由本研究所保存。1.1.2试剂去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒，小量细胞总RNA快速抽提纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品；RTPCR试剂盒为Fermentas产品；内切酶、Taq酶、T4DNA连接酶和DL2000Marker购自

6、TaKaRa公司;一抗为survivin兔IgG多抗(FL142)购自SantaCruz公司；二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司;转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;PIAnnexinV双染试剂盒购自Immuntech公司;引物和寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成；DMSO、Tris碱和甘氨酸购自Sigma公司；细胞培养用RPMI1640购自Gibco/BRL公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1靶向sur

7、vivin的siRNA表达载体的靶序列的选择和合成以人survivin（NM001168）为对象，根据RNA设计原则[3]和survivin编码序列,利用Stratagene公司和Invitrogene公司的在线设计程序siRNA1.0分别设计19和29nt的DNA片段各一,其中19nt的靶序列针对survivin的开放读码框的第387bp405bp,其序列为5′GAAAGTGCGCCGTGCCATC3′，而29nt的靶序列针对survivin的开放读码框的第248bp276bp，其序列为5′GTTGCGCTTTCCTTT

8、CTGTCAAGAAGCAG3′上述两个侯选序列通过美国生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）同源序列检索确定与其他基因家族没有同源性后进行载体构建。根据上述结果分别合成两对针对survivin编码序列的正义和反