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时间:2018-11-21
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1、瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义论文【摘要】目的:探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法,为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源.方法:采用CysA法、微量全血法和冻存全血法3种不同方法建立B淋巴母细胞样细胞系(BLCL),比较各方法建系成功率及时间.结果:成功建立了一瘢痕疙瘩家系的永生细胞株,其中CysA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为96.4%,46.4%,28.6%;建立细胞系平均所需时间分别为28.8d,39.7d,46.3d.结论:CysA法成功率高.freelphoblastoidcelllines,LCL),建立了
2、此家系的外周血淋巴细胞永生细胞库,并对此3种转化方法进行了比较和评价.1材料和方法1.1材料产生EBV的B958细胞株由中国医学科学院遗传与发育生物学研究所徐玖瑾教授馈赠,RPMI1640培养基(Gibco公司);特级胎牛血清(HyClone公司);淋巴细胞分离液,环孢霉素A及二甲基亚砜(Promega公司);FITC标记的鼠抗人CD19mAb和PE标记的鼠抗人CD23mAb及同型对照(法国ACOULTER公司).此瘢痕疙瘩家系来自我国东北,所有成员均有完整详细的资料.共采集了包括先证者所在核心家庭及发病人数较多的一个家庭共4代28个成员的外周血标本,男女比率3∶4,年龄
3、3~76岁,其中瘢痕疙瘩患者5例,病程10~30a不等.所有血样都在无菌条件下抽取,常温带回实验室.1.2方法1.2.1EBV悬液的制备复苏B958细胞株,加入无血清RPMI1640,1000r/min离心10min,弃上清,加入RPMI1640完全培养基培养.每2~3d半量加液1次,待细胞数达到1×1010/L时,饥饿细胞4~7d,收集上清液,-70℃及37℃反复冻融3次,1800r/min离心15min,0.22μm滤膜抽滤,-70℃冰箱保存备用.1.2.2CysA法取5mL肝素抗凝血,室温放置24h,加入2mL无血清1640培养液,混匀,沿管壁小心加在4mL淋巴细胞
4、分离液上,2500r/min离心30min,将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中,加入10mL无血清1640培养液洗涤3次,然后将洗涤后的白细胞用2mLRPMI1640完全培养基重悬,加入1.3mLEBV悬液和0.4mLCysA,充分混匀后等量移入2个10mL培养瓶内,置于37℃,50mL/LCO2培养箱培养;7d左右镜下观察,此后每周两次半量换液;约2L肝素抗凝血,直接加1.0mLEBV悬液及1mLRPMI1640完全培养基,置于37℃,50mL/LCO2培养箱培养;每周加0.5mLRPMI1640完全培养基.3~4L,加入100mL/L二甲基亚砜(DMSO),混合后置-7
5、0℃低温冰箱2d内移至液氮中,每个样本冻存2~3支.1mo后,将冻存血标本从液氮中取出,置37℃水浴中迅速解冻,用10mL无血清RMPI1640培养液1000r/min离心2min,弃上清,留沉淀细胞;用2mL含RMPI1640完全培养基悬浮细胞,加入1mLEBV悬液,混合后移入10mL培养瓶内,置于37℃,50mL/LCO2培养箱培养,根据转化和细胞生长情况加液、换液、转瓶和传代.1.2.5转化细胞株的冻存与复苏细胞株在冻存前一天必须加新鲜的培养液,24h后收集细胞至离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,用1mL冻存液(950mL/L的胎牛血清+50mL/L
6、的二甲基亚砜)重悬细胞,放置-70°C的冰箱1h后或隔夜进入液氮柜中保存.细胞复苏时迅速将冻存管放入37℃水浴,当冻存管中尚存有少量冰块(约0.4cm×0.3cm×0.2cm)时立即进入超净台中,整个时间约1min左右,解冻后的细胞直接进入全培养液中,无须离心洗涤.核对培养瓶上标记的细胞代码、号数及冻存日期后,置入37℃培养箱内,细胞可连续传代培养6mo以上.1.2.6细胞株染色体核型分析对转化前后及培养3~6mo的细胞进行染色体核型分析,取指数增殖期的淋巴细胞悬液5mL注入另一培养瓶中,加入完全培养基5mL,37℃培养48h,加入秋水仙碱,终浓度为0.4g/L,继续培养2
7、h后,常规收获、制片,G显带后进行染色体核型分析并显微照相.1.2.7LCL细胞膜表面标志鉴定CD19和CD23分子的检测,5×106的LCL经PBS洗涤2次,200μLPBS重悬,分别与FICT和PE标记的CD19和CD23mAb避光孵育45min,同时设相应的阴性同型对照.PBS洗2次,流式细胞仪检测1×105个细胞,分析细胞膜上CD19和CD23分子的表达.2结果2.1不同方法转化情况转化瘢痕疙瘩家系28例外周血标本,CysA法、微量全血法和冻存全血法的建系成功率分别为96.4%,46.4%和28.6%;建系
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