瘢痕疙瘩家系外周血b淋巴母细胞系的建立方法及意义论文

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1、瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义论文【摘要】目的:探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法，为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源.方法:采用CysA法、微量全血法和冻存全血法3种不同方法建立B淋巴母细胞样细胞系（BLCL），比较各方法建系成功率及时间.结果:成功建立了一瘢痕疙瘩家系的永生细胞株，其中CysA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为96.4%，46.4%，28.6%；建立细胞系平均所需时间分别为28.8d，39.7d，46.3d.结论:CysA法成功率高.freelphoblastoidcelllines,LCL），建立了

2、此家系的外周血淋巴细胞永生细胞库，并对此3种转化方法进行了比较和评价.1材料和方法1.1材料产生EBV的B958细胞株由中国医学科学院遗传与发育生物学研究所徐玖瑾教授馈赠，RPMI1640培养基（Gibco公司）；特级胎牛血清（HyClone公司）；淋巴细胞分离液，环孢霉素A及二甲基亚砜（Promega公司）；FITC标记的鼠抗人CD19mAb和PE标记的鼠抗人CD23mAb及同型对照（法国ACOULTER公司）.此瘢痕疙瘩家系来自我国东北，所有成员均有完整详细的资料.共采集了包括先证者所在核心家庭及发病人数较多的一个家庭共4代28个成员的外周血标本，男女比率3∶4，年龄

3、3～76岁，其中瘢痕疙瘩患者5例，病程10～30a不等.所有血样都在无菌条件下抽取，常温带回实验室.1.2方法1.2.1EBV悬液的制备复苏B958细胞株，加入无血清RPMI1640，1000r/min离心10min，弃上清，加入RPMI1640完全培养基培养.每2～3d半量加液1次，待细胞数达到1×1010/L时，饥饿细胞4～7d，收集上清液，-70℃及37℃反复冻融3次，1800r/min离心15min，0.22μm滤膜抽滤，-70℃冰箱保存备用.1.2.2CysA法取5mL肝素抗凝血，室温放置24h，加入2mL无血清1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4mL淋巴细胞

4、分离液上，2500r/min离心30min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中，加入10mL无血清1640培养液洗涤3次，然后将洗涤后的白细胞用2mLRPMI1640完全培养基重悬，加入1.3mLEBV悬液和0.4mLCysA，充分混匀后等量移入2个10mL培养瓶内，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养；7d左右镜下观察,此后每周两次半量换液；约2L肝素抗凝血，直接加1.0mLEBV悬液及1mLRPMI1640完全培养基，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养；每周加0.5mLRPMI1640完全培养基.3～4L，加入100mL/L二甲基亚砜（DMSO），混合后置-7

5、0℃低温冰箱2d内移至液氮中，每个样本冻存2～3支.1mo后，将冻存血标本从液氮中取出，置37℃水浴中迅速解冻，用10mL无血清RMPI1640培养液1000r/min离心2min，弃上清，留沉淀细胞；用2mL含RMPI1640完全培养基悬浮细胞，加入1mLEBV悬液，混合后移入10mL培养瓶内，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养，根据转化和细胞生长情况加液、换液、转瓶和传代.1.2.5转化细胞株的冻存与复苏细胞株在冻存前一天必须加新鲜的培养液，24h后收集细胞至离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，用1mL冻存液（950mL/L的胎牛血清+50mL/L

6、的二甲基亚砜）重悬细胞，放置-70°C的冰箱1h后或隔夜进入液氮柜中保存.细胞复苏时迅速将冻存管放入37℃水浴，当冻存管中尚存有少量冰块(约0.4cm×0.3cm×0.2cm)时立即进入超净台中，整个时间约1min左右，解冻后的细胞直接进入全培养液中，无须离心洗涤.核对培养瓶上标记的细胞代码、号数及冻存日期后，置入37℃培养箱内，细胞可连续传代培养6mo以上.1.2.6细胞株染色体核型分析对转化前后及培养3～6mo的细胞进行染色体核型分析，取指数增殖期的淋巴细胞悬液5mL注入另一培养瓶中，加入完全培养基5mL，37℃培养48h，加入秋水仙碱，终浓度为0.4g/L，继续培养2

7、h后，常规收获、制片，G显带后进行染色体核型分析并显微照相.1.2.7LCL细胞膜表面标志鉴定CD19和CD23分子的检测，5×106的LCL经PBS洗涤2次，200μLPBS重悬，分别与FICT和PE标记的CD19和CD23mAb避光孵育45min，同时设相应的阴性同型对照.PBS洗2次，流式细胞仪检测1×105个细胞，分析细胞膜上CD19和CD23分子的表达.2结果2.1不同方法转化情况转化瘢痕疙瘩家系28例外周血标本，CysA法、微量全血法和冻存全血法的建系成功率分别为96.4%，46.4%和28.6%；建系