opcml对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究

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1、OPCML对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究作者：姚德生,李力,KenhGarson,BarbaraCVanderhyden【摘要】目的探讨OPCML在体外、体内对卵巢癌细胞的影响。方法将OPCML用重组慢病毒转导入人卵巢癌细胞A2780、OCC1和正常小鼠卵巢上皮细胞CD1。通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验、细胞周期的分析和体内成瘤试验等来研究OPCML在卵巢癌细胞中的功能。结果（1）OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，转导效率几乎达100%，同时达到稳定的表达，L(60kDa)和GFP(27kDa)基因蛋白在靶细胞中的表达；（2）在A278

2、0细胞系，转导入OPCML后的细胞（A2780OPCML）的增殖明显的比未转基因（A2780）或仅转空载体（A2780pL对细胞的增殖无明显的影响（P>0.05）；（3）用流式细胞仪法对细胞周期分析显示，OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用（P<0.05），但对OCC1、CD1细胞则无明显滞留作用；（4）细胞聚合力试验提示OPCML能明显增强细胞的粘附力；（5）表达OPCML的A2780细胞在裸鼠皮下仅有一个（1/4）有肿瘤生长，体积显著小于A2780及A2780-pL蛋白在肿瘤组织中的表达。结论慢病毒载体作为转基因的工具

3、，具有高效转导率和稳定表达的特点；OPCML能够增加细胞的粘附能力，抑制A2780的增殖和体内成瘤，提示OPCML可能是一个新的抑癌基因。【关键词】OPCML；卵巢癌；慢病毒载体；基因转移；移植瘤模型　　Keyodel　　0引言OPCML(OpioidbindingprotEin/celladhesionmoleculelike)定位于人染色体11q25，而已有的研究证实在这个区域的杂合子缺失（LOH）与卵巢上皮癌的不良预后相关。因而提示在这个区域可能存卵巢癌的抑癌基因。OPCML与肿瘤的关系目前尚不清楚。我们已经从正常组织中克隆OPCML全长基

4、因，并克隆到了慢病毒载体（Lentiviralvector），为了进一步明确OPCML的功能，本研究利用重组慢病毒将OPCML转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞及质粒来源　　人胚胎肾上皮细胞293T、人卵巢浆液性囊腺癌细胞系A2780、人卵巢透明细胞癌细胞系OCC1和小白鼠正常卵巢上皮细胞系CD1均为渥太华大学癌症中心保存和提供，293T、A2780和OCC1均不表达OPCML。质粒pVdR8.74和pMDG由瑞士InstituteofTechnologyLausanne由Trono

5、博士惠赠；OPCML表达质粒pL由本研究组构建。　　1.1.2单抗、试剂盒、酶、试剂及引物来源　　OPCML单克隆抗体由英国爱丁堡大学EricMiller博士惠赠。兔抗GFP多克隆抗体购自美国SantaCruz公司，FuGEN6转染试剂盒购自美国Roche公司。山羊抗鸡多抗购自加拿大Abcam公司。　　1.2方法　　1.2.1重组慢病毒介导的基因转移　　用磷酸钙沉淀法[1]将pL+pCMV.dR874+pMDG共转染包装细胞293T，获得携带目的基因OPCML和GFP基因的重组病毒(实验组)，同时共转染pV.dR874+pMDG进另一组293T作为

6、对照（空载体对照组）。按　　2.2L在卵巢癌细胞系中表达结果L转导入靶细胞后，分别能检测到OPCML和GFP蛋白质的表达，而对照组pL蛋白表达，见图1。　　2.3OPCML对细胞增殖能力的影响将OPCML转导入A2780细胞后，细胞增殖速度显著慢于空白组（A2780）和对照组（A2780pL对细胞的增殖无明显的影响（P>0.05），提示OPCML能够抑制A2780的增殖，但对OCC1和CD1无明显的抑制作用，见图2。　　2.4OPCML对细胞周期的影响FCM检测显示OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用，转导OPCML后停留在G0～

7、G1期细胞数（75.1%）比转导前的细胞数（66.5%）明显增多（P<0.05），但对OCC1和CD1无明显的滞留作用（P>0.05）。　　2.5OPCML对细胞聚合力影响细胞聚合力试验显示随着培养时间的增长，单个细胞的数目在A2780-OPCML组显著少于对照组A278-pL能明显增强细胞的粘附力，有助于抑制肿瘤的转移，见图3。　　2.6OPCML对体内移植瘤生长抑制的影响注射A2780和A2780/pL细胞的4只裸鼠中仅1只有肿瘤形成，其重量仅为10mg。后者在裸鼠体内成瘤重量与前两者分别比较，差异均有统计学意义(P<0.01)

8、，但前两者间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。　　2.7荧光显微镜检测移植瘤中GFP蛋白的表达结