opcml对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究论文

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1、OPCML对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究论文姚德生,李力,KenhGarson,BarbaraCVanderhyden【摘要】目的探讨OPCML在体外、体内对卵巢癌细胞的影响。方法将OPCML用重组慢病毒转导入人卵巢癌细胞A2780、OCC1和正常小鼠卵巢上皮细胞CD1。通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验、细胞周期的分析和体内成瘤试验等来研究OPCML在卵巢癌细胞中的功能。结果（1）OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，转导效率几乎达100%，同时达到稳定的表达，L(60kDa)和GFP(27kDa)基因蛋白在靶细胞中的表达；（2）在A2780细胞系，转导入OPCML后的细胞（A2780

2、OPCML）的增殖明显的比未转基因（A2780）或仅转空载体（A2780pL对细胞的增殖无明显的影响（P0.05）；（3）用流式细胞仪法对细胞周期分析显示，OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用（P0.05）.freelodel0引言OPCML(Opioidbindingprotein/celladhesionmoleculelike)定位于人染色体11q25，而已有的研究证实在这个区域的杂合子缺失（LOH）与卵巢上皮癌的不良预后相关。因而提示在这个区域可能存卵巢癌的抑癌基因。OPCML与肿瘤的关系目前尚不清楚。我们已经从正常组织中克隆OPCML全长基因，并克隆到了慢病毒载体

3、（Lentiviralvector），为了进一步明确OPCML的功能，本研究利用重组慢病毒将OPCML转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞及质粒来源人胚胎肾上皮细胞293T、人卵巢浆液性囊腺癌细胞系A2780、人卵巢透明细胞癌细胞系OCC1和小白鼠正常卵巢上皮细胞系CD1均为渥太华大学癌症中心保存和提供，293T、A2780和OCC1均不表达OPCML。质粒pVdR8.74和pMDG由瑞士InstituteofTechnologyLausanne由Trono博士惠赠；OPCML表达质粒pL由本研究组构建。1.1.2单抗、试剂盒、酶、试剂及引

4、物来源OPCML单克隆抗体由英国爱丁堡大学EricMiller博士惠赠。兔抗GFP多克隆抗体购自美国SantaCruz公司，FuGEN6转染试剂盒购自美国Roche公司。山羊抗鸡多抗购自加拿大Abcam公司。1.2方法1.2.1重组慢病毒介导的基因转移用磷酸钙沉淀法1将pL+pCMV.dR874+pMDG共转染包装细胞293T，获得携带目的基因OPCML和GFP基因的重组病毒(实验组)，同时共转染pV.dR874+pMDG进另一组293T作为对照（空载体对照组）。按文献方法1分别获取重组慢病毒，后用之感染A2780、OCC1和CD1细胞系，分别获得表达OPCML和GFP的细胞系A2780O

5、CML、OCC1OPCML、CD1OPCML以及仅携带有荧光蛋白GFP的A2780pL基因表达检测1.2.2.1重组慢病毒介导基因转导效率的检测重组病毒感染48h后，将培养皿放在荧光显微镜下，观察有绿色荧光（GFP）的细胞数，判断感染的效率。同时可用FCM（流式细胞仪）检测GFP阳性细胞百分数：将1×106细胞离心沉淀，用PBS洗2次将细胞重新悬浮于1mlPBS中，尽可能吹打成单个细胞；在流式细胞仪上检测GFP阳性细胞数，验证慢病毒感染效率（转基因效率）。1.2.2.2采用L的表达重组病毒感染细胞72h后，收集靶细胞蛋白，L蛋白质和标记蛋白GFP的表达。一抗分别为鸡抗OPCML的单体和兔

6、抗GFP的多克隆抗体，二抗为相应的山羊抗鸡或山羊抗兔的多克隆抗体，用微管蛋白(Tubulin)作为内对照。1.2.3OPCML对卵巢上皮癌细胞生物行为影响的体外实验1.2.3.1细胞增殖试验一式三份5×104个对数生长期的细胞A2780,A2780pL,OCC1,OCC1pL，CD1,CD1pL被分别培养在6孔的培养平板中，72h后用胰酶消化，收集细胞，并吹打成单个细胞，并用自动细胞计数仪计算细胞数，重复3次相同的实验。1.2.3.2细胞聚合力试验将对数生长期的A2780OPCML细胞及对照组A2780pEM的离心管中，于37℃含5%CO2的培养箱中培养。每隔15min，用宽口移液管

7、头吸取30μl培养液，加入30μl苔盼蓝，显微镜下计算单个活细胞数，计算单个细胞所占的百分数；重复3次相同实验。1.2.3.3细胞周期测定用碘化丙啶染色法，用流式细胞仪按说明操作检测转染OPCML前后靶细胞的细胞周期变化。1.2.4体内移植瘤形成试验分别将5×106个A2780、A2780pL（200～400μl）注射到体重相同的雌性CD1裸鼠皮下（每组共四只）；观察肿瘤的形成和进展，4周时，因部