ad5-f35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究论文

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1、AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究论文.freelatopoieticCellsofDifferentOriginsAbstractThisstudyedtoinvestigatethetransfectionefficiencyofadenoviralvectorAD5/F35tohematopoieticmalignantcellslinesofvariousoriginsandAD5/F35cytotoxicity.Thehematologicmalignantcelllin

2、esofvariousoriginsultipleofinfection(MOI)andAD5-EGFPetry;thekillingeffectofvirusoninfectivetargetcellsicroscopy.Theresultsshoyeloidoriginatologicmalignantcellsofvarionsorigin，theinfectionabilityofAD5/F35vectortocellsofmyeloidoriginisstrongerthanthattocellsof

3、Bcellorigin，thecytotoxicityofAD5/F35vectortoinfectivetargercellsissmall.TheAD5/F35vectorispreferabletoAD5vectorinrespectofinfectionabilityandoffersgoodprospectsofapplicationingenetherapyformyeloidleukemiacellsastargetcells.Keyalignanthematopoieticcellline腺病毒

4、载体是基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一。传统的腺病毒载体基本都是以5型腺病毒为基础构建的，但5型腺病毒载体对造血细胞感染效率低下，在一定范围上限制了它的使用。有研究表明，用35型腺病毒的纤突蛋白改造5型腺病毒可以有效提高对造血干细胞的感染效率［1］。我们使用携带EGFP报告基因的AD5/F35载体，比较了它对不同来源的血液系统恶性细胞感染效率的差异及对所感染靶细胞的毒性作用。材料和方法材料试剂RPMI1640培养液（Gibco公司产品），胎牛血清（Hyclone公司产品），MTT（华美公司产品）。DMSO(S

5、igma公司产品)。细胞CEM（急性T淋巴细胞白血病细胞株）、HPB-ALL（急性T淋巴细胞白血病细胞株）、Daudi（Bukitt淋巴瘤细胞株）、K562（慢性髓系白血病细胞株）均由中国医学科学院肿瘤研究所提供。病毒AD5-EGFP（滴度6.3×109TCID50/ml），AD5/F35-EGFP（滴度1.3×109TCID50/ml）。两病毒均由国家863病毒载体研发基地制备。仪器流式细胞仪（Courter公司产品），荧光倒置显微镜（LeicaDLIL德国Leica公司产品），酶标仪，CO2培养箱（Hera

6、eus公司产品）。方法感染效率检测受试细胞在25cm2方瓶用10%FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入EP管，每管5×104细胞，体积为100μl。分为2组，其中1组感染AD5/F35-EGFP病毒，另1组感染AD5-EGFP病毒。用无血清培养基将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓度的病毒的病毒悬液，分别以MOI为0、10、30、100、300、1000加入病毒液到细胞管中混匀，37℃水浴感染2小时。1500rmp低速离心10分钟，弃去感染上清，用无血清培养

7、液清洗细胞2遍，转入24孔板，用含10%FBS培养液继续培养48小时。流式细胞仪检测不同感染MOI下荧光阳性细胞比例，并且在荧光显微镜下照相。毒性试验受试细胞在25cm2方瓶用10%FBS培养液培养至对数生长期进行试验。将受试细胞计数后分入96孔板，每孔1×104细胞，体积为100μl。每种细胞设AD5-EGFP组、AD5/F35-EGFP组、空白对照组。每个病毒组设MOI为10、100、10003个感染剂量，每个剂量设3个复孔。用无血清培养液将AD5/F35-EGFP病毒和AD5-EGFP病毒原液稀释成不同浓

8、度的病毒悬液，每孔加入100μl，使感染MOI分别达到10、100、1000。在37℃，5%CO2条件下培养48小时。然后用MTT法检测细胞毒性：每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，37℃孵育4小时；2000rmp离心10分钟，小心去除上清；每孔加入DMSO10μl，震荡；酶标仪测570mm吸光度（如超出酶标仪上限将全部测试孔稀释1倍后再测）。根据吸光度计算杀伤效率。结果感染效率流