四种病毒载体对人成纤维细胞转染效率的研究

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1、第三军医大学硕士学位论文四种病毒载体对人成纤维细胞转染效率的研究木摘要基因治疗是指将目的基因用基因转移技术导入目的细胞进行表达，使其获得特定的功能，从而达到治疗的目的【1】。基因治疗由三个方面组成：受体细胞、载体以及目的基因。皮肤成纤维细胞(denIlal舶roblasts，DFs)获取方便，可以在体外大量扩增，容易进行遗传改造，并且具有容易移植和不易转化的优点，因此DFs成为目前基因治疗应用较为广泛的靶细胞，本论文亦将此细胞作为研究对象。目前，基因治疗面临的瓶颈问题在于转染效率低下，而决定基因治疗转染效率的关键点之一就在于载体

2、的选择。目前基因治疗所应用的载体主要包括病毒载体和非病毒载体，其中应用最多的是病毒载体，包括逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒【翻，其中前四种已经被美国FDA批准应用于临床。在人类基因治疗常用的病毒载体中，腺相关病毒(Adeno．associatedviruses，AAV)的安全优势以及长效表达的优点【¨】使其成为了基因稳定转染的宠儿。而腺病毒(Adenovirus，Ad)载体则因具有感染效率和外源基因表达水平高、高滴度制备较简单等特点而被广泛用于基因治疗研究和临床试验中(舶j。因此，本论文选择AAV和Ad为研究对

3、象。由于病毒载体的衣壳蛋白是决定其对靶细胞嗜性的主要因素，进行衣壳蛋白改造后的载体有望改变载体亲嗜性而提高转染效率。我们在选用常规使用的MV2和Ad5的基础上，还选用了将丸AV2的ITRs包被进入灿W1的衣壳蛋白形成的嵌合型载体——舢w2／1，以及将A-d35载体的纤突整合到Ad5载体上形成的Ad5腰35作为研究对象，通过比较他们的转染效率来筛选适合DFs的载体。本学位论文以eGFP为报告基因，以流式细胞检测(flowcytometry，FCM)和荧光显微照相为研究手段，比较丸W2．eGFP、AAV2／1．eGFP、Ad5．eG

4、Fp和Ad5／F35．eGFP对DFs的转染效率，探讨了四种病毒载体转染DFs的适合条件，同时利用MTT法研究四种病毒载体转染后DFs的增殖性能，希望筛选出对DFs嗜性较高的载体，同时也进一步为成纤维细胞用于基因治疗的规模化生产应用提供实验和理论依据。AAV2．eGFP和～w2／1．eGFP分别按照转染倍数MOI为104、105j106转染DFs，Ad5．eGFp和Ad5／F35．eGFP按照感染复数MOI为10、25、50、100转染DFs，转染后24h用流式细胞检测转染效率，荧光显微镜观察转染后的荧光强度，MTT检测两者对D

5、Fs增殖’本研究获得国家863计划项目(2006从02A121)。4第三军医大学硕士学位论文的影H向。实验结果如下：AAV2／1．eGFP对DFs无感染能力，MOI105时丸W2转染DFs24h后转染效率可达到(22．16+5．59)％，表明AAV2转染DFs可以有效获得皮肤基因修饰细胞，进一步用于基因治疗和基因修饰。Ad5．eGFP和Ad5／F35．eGFP在MOI为lO、25、50、100时转染效率I逋着MOI升高而呈上升趋势，MOI100时，Ad5缗35．eGFP转染DFs24h后转染效率可达到90％左右，Ad5．eGFP

6、达到70％左右。综合实验结果分析，结论如下：Ad5／F35是四种载体中转染效率最高的载体，最适合实际生产应用和临床使用。魁W2载体能成功转染DFs，获得基因修饰细胞，本文所选的两种灿W载体不能解决转染效率低的问题。细胞；关键词：腺相关病毒；腺病毒；人皮肤成纤维细胞；增强型绿色荧光蛋白；流式第三军医大学硕士学位论文FourviralveCtormediatedtransf．ectionint0human1l一''』●●．dermalnDr0DlaStZ以VZ加AbStractGenemerapyistheintmductionof

7、geneticmaterialintocellsfortherapeuticpu印oses．Therearethreeelementsingenetherapy．TheyareVector，ta玛etcellsandta玛etgene．Demalfibroblasts(DFs)arearecoIⅣenienttoobtainandpr01ifica11dhardtoinvert．ThesecharacteristicsdemonstratethatDFsareproperta唱etcellswhichcanbewidelyuse

8、dinbothgenether印ya11dgenemodification．Recentfindingssuggestthatmajorbreaktllroughsinlowtransfectionrateforgenether印yareimminent，thu