导向性ifnα2aαmsh基因的克隆、表达、纯化及鉴定论文

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1、导向性IFNα2aαMSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定论文【关键词】干扰素α2a；α促黑素；大肠杆菌；基因表达；pET22b(+)载体IFNα2a是一种具有抗肿瘤活性的细胞因子，已被FDA批准用于多种恶性肿瘤的治疗，但因其在临床治疗中需大剂量长期给药且常会引发明显的毒副作用，使其应用受到一定的限制.αMSH是一种由多种细胞分泌的含13肽的激素，也是一种天然存在的多肽，目前的研究证实其可通过免疫调节作用抑制恶性黑色素瘤细胞的黏附、侵袭和转移［1-2］.Froidevanx等［3］研究表明所

2、有黑素细胞和黑素瘤细胞都表达αMSH受体MC1R，且黑素瘤细胞表达MC1R上调，人黑素瘤细胞表面MC1R密度为900~5700结合位点/细胞.freeliTM2(DE3)，药学系生物技术中心保存；各种限制性内切酶，T4DNA连接酶以及DNAMarkerDL2000（TaKaRa公司）；片段合成与序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（Omega公司）；低Mr蛋白标准（MBI公司）；鼠抗人干扰素α（SantaCruz公司）；羊抗鼠IgGAp（华美工程公司

3、）：显色剂（美国Promega公司）；蛋白胨、酵母粉、低熔点琼脂糖（Spanish公司）；异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG，华美生物工程公司）；其他试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1IFNα2aαMSH融合基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码αMSH导向肽的核苷酸片段：片段1（48nt）：5′GATCCTCCTACTCCATGGAACACTTCCGTTGGGGTAAACCGGTTTAGG3′；片段2（48nt）：5′TCGACCTAAACCGGTTTACCCCAA

4、CGGAAGTGTTCCATGGAGTAGGAG3′.这两个片段退火后可形成αMSH导向肽的核苷酸片段以及5′端和3′端的粘性末端（BamHI和SalI的酶切位点）；将合成的两个片段煮沸变性10min后退火，再与用BamHI和SalI双酶切处理过的pET22b（+）IFNα2aNGR质粒连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，培养筛选阳性克隆(图1).1.2.2重组质粒的酶切和测序从抗生素琼脂培养平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，用限制性内切酶NdeⅠ和N

5、coⅠ进行双酶切鉴定及核酸序列分析.将测序正确者命名为pET22b（+）IFNα2aαMSH.1.2.3重组蛋白的诱导表达重组质粒pET22b(+)IFNα2aαMSH转化感受态细胞RosettagamiTM2(DE3)，挑取mAb接种于含氨苄青霉素（50mg/L）、四环素（25mg/L）、链霉素（10mg/L）及氯霉素（35mg/L）的LB培养基中，次日清晨按1∶100的比例接种于上述同样条件的LB培养基中，37℃培养至A600nm=0.4～0.6时加入IPTG至终浓度

6、为1mmol/L诱导表达，37℃振荡培养4h，离心收集菌体，行SDSPAGE鉴定.1.2.4IFNα2aαMSH的初步纯化和SH是以包涵体的形式存在，取5g表达湿菌，将其悬浮于35mLSTE(100mmol/LNaCl,50mmol/LTris.Cl,PH8.0,1mmol/LEDTA)中，在冰浴中300SH的酶切鉴定用限制性内切酶NdeⅠ和NcoⅠ对重组质粒pET22b(+)IFNα2aαMSH进行双酶切，可见一约530bp片段，与预期大小一致，证明目的片段已插入pET22

7、b(+)载体中（图2）.测序结果与合成的αMSH基因序列比对完全一致.2.2IFNα2aαMSH在大肠杆菌中的诱导表达SDSPAGE电泳结果表明，含有pET22b(+)IFNα2aαMSH的工程菌RosettagamiTM2(DE3)经1mmol/LIPTG诱导后在约20ku处产生了一条新生蛋白条带，与预期结果相符合；而未诱导的则无相应蛋白条带出现（图3）.2.3超声裂菌及溶菌酶裂菌经溶菌酶裂菌证实重组蛋白IFNα2aαMSH是以包涵体的形式存在，采用超声裂菌的方法裂解菌体细胞，发

8、现在裂菌上清中出现IFNα2aαMSH目的蛋白条带（图4）.2.4IFNα2aαMSH的纯化和SH（图5），纯化产物的SH重组蛋白含量及活性的检测溶菌酶裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分别为6.4×108U/L,.freel5NGR［4-5］.IFN是第一个应用于临床的基因工程产品，但在实体瘤的治疗中，注射入体内的IFN很少能达到肿瘤部位，因而治疗效果较差［1-2］，αMSH可与黑素瘤细胞表面的MC1R特异性结合，促进恶性黑色素瘤细胞的凋亡，并且通过皮肤基底膜的重建而抑制皮肤黑素瘤