大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法论文

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1、大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法论文罗蕾刘红余德芊刘爱东高原【摘要】目的：以Doucet介绍的方法为基础，改良了测定大鼠肾脏近端小管Na+K+ATPase活性的方法。方法：首先，利用自制的玻璃分针能准确而迅速的分离获取近端小管；其次，使用传导性能较好和易于折叠的锡箔纸代替了铝片，简化了孵育和测定过程。结果：改良方法与Doucet建立的经典方法比较，测定结果无显著性差异(P＞0.05)；但对小管长度确定平均耗时和转移含32P的孵育液平均耗时明显降低。结论：本文介绍的测定大鼠肾脏近端小管Na+K+ATPase活性的改良方法，

2、减少操作步骤，缩短了操作时间和暴露在放射性环境中的时间；简化并改进了操作条件.freela）。γ32PATP(北京福瑞特公司)。XTJ5400体视显微镜（广西梧州光学仪器厂），配套显像系统购自日本Unican公司。SN6930A型液体闪烁计数器(上海核所日环公司)。基础分离液、液闪液及钠泵活性测定液的配制参照Doucet1990年报告的方法2。2实验方法选取10只大鼠，平均分为2组，分别用于Doucet法和改良法测定小管的钠泵活性，改良法实验方法如下：2.1单根肾近球小管的分离实验大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg·kg-1，ip）麻

3、醉后，右侧位固定于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤，暴露肾脏，分离腹主动脉，结扎除左肾动脉以外的分支，经腹主动脉插管灌注左肾，先用1ml1%肝素钠溶液，接着用1ml0～4℃含0.2%胶原酶的分离液灌注。灌注后迅速切下左肾，除去肾包膜和肾蒂结构，置于洁净玻片上（玻片下放置低温冰袋）。用剃须刀片，将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.5～1.0mm厚的薄片。将大约10片肾组织放入一容积为2ml的离心管中，管内预先装有1ml含0.15%胶原酶的分离液并预热至37℃，恒温水浴槽中孵育15～20min，持续充入95%的O2和5%CO2的混合气体。孵育完毕用2m

4、l含0.05%牛血清白蛋白的分离液漂洗3～4次，0～4℃保存并于30min内完成分离。吸取0.1ml含肾小管组织的分离液到细菌学载玻片的中央凹处，在体视镜载物台上放置一个直径为90mm培养皿，内装洁净冰水和碎冰块，在培养皿内放置一个合适铝架，载玻片平放在铝架上，使玻片底部刚好与冰水接触（提供0～4℃的分离环境），用微分离针分离小管。辨认近球小管是根据它与肾小球、肾小囊、入球小动脉和其它肾小管节段的解剖关系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片，根据放大倍率确定小管长度。2.2单根肾近球小管钠泵活性测定将0.5×0.5cm大小

5、的锡箔纸15片紧贴在铝合金属盘内，纸片中央滴加5μl分离液，10根分离的单根小管分别转移到其中10片纸片上的分离液中，5片不含小管的作空白对照。分别用5μl蒸馏水代替小管周围等渗液，用保鲜膜密封金属盘，4℃，15min后，重新用5μl蒸馏水替换。随后，将密封金属盘直接与－80℃的超低温冰袋接触使其快速冰冻，然后将金属盘放置在0～4℃的冰箱内，待其逐渐融化后，含小管的10张锡箔纸片随机分成两组，分别滴加1μl测定总ATP酶或Mg2+ATP酶活性的孵育液。将金属盘密封后放入37℃水育箱，孵育15min后将金属盘移到碎冰上，分别加入5μl5

6、%冷三氯醋酸终止反应。分别将锡箔纸连同反应液转移到含有2ml10%活性炭悬液的试管中，混匀后离心沉淀（2500rpm，10min），取上清500μl直接放入含5ml液闪液的计数瓶，将液闪瓶放入液体闪烁计数器中，静止3小时，测定各样本CPM值。采用Doucet建立的公式计算，钠泵活性用单位长度小管单位时间水解ATP释放无机磷的数量来表示（pmol·mm-1·h-1），即以酶促反应速度表示酶的活性。3结果3.1微分离小管的结果图片见图1，A表示转移后的单根肾近球小管节段；B表示微分离的近球小管电镜图象。电镜下可见近球小管管腔面排列有长而密集

7、的微绒毛（箭头所示），它是近球小管独特的超微结构。其次可见侧突发达，质膜内褶较深，可达细胞的游离面，胞吞小泡多，溶酶体发达，长杆线粒体十分丰富，与质膜内褶平行排列。3.2两种方法钠泵活性测定结果与部分操作耗时比较结果见表1，运用改良法测定钠泵活性结果无显著差异，但对小管长度确定平均耗时和转移含32P的孵育液平均耗时明显降低。表1两种方法测定结果与部分操作耗时比较注：*与Doucet法比P＜0.054讨论测定肾小管钠泵的活性，Doucet法仍是目前最常用的方法。本实验技术是在Doucet法的基础上，进行了较大的改进和完善，使实验条件和实验

8、本身变得相对简单易行，可操作性大为提高，而且对测定结果并无明显影响。本实验方法的改进主要体现在以下十个方面：①固定方法：与以往仰位固定比较，右侧卧位固定，沿脊柱左侧手术，左肾动脉及腹主动脉暴露充分，手术过程