大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定.doc

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1、大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定作者：王光兰陈爽张丽红范颖石英爱孙华君刘晓会吴珊【摘要】目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法无菌取Wistar大鼠肾脏，取皮质剪碎，经I型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代，观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果培养4〜5d细胞融合成单层，呈典型的鹅卵石样，细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性，细胞可传2〜3代。结论此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞，为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。【关键词】近端肾小管上皮细胞

2、；原代培养;大鼠【Abstract】ObjectiveToestablishthebettermodeofratproximaltubulTCs).MethodsWistariletakenout,thenthdandshredded,purifigestionand45%percnsitygradientcentrandpassagedbyDMEM/lforprimarycultureeepithelialcells(PratskidneyweresterecortexwasseparateiedbycollagenaseIdolldiscontinuousdeifugation,cult

3、uredFI2mediumsupplemenineserum,identifienocytochemistrystar4to5days,thecellsoasinglelayerandshtedwithlO%fetalbovdbymorphology,immuiningandenzymeAftewereinosculatedintowedthetypicalcobb1estoneellscouldbepassed21d1argequantityandgoodrepeatabilityPTCsinshortterm，thosecellscanprovideanexperimentalplatf

4、likecytokeratinl8andalkalinephosphatasestainingwerepositive，thee3Thismethodcanyieormfortheresearchofpathologicalchangesandlesions.【Keywords】Proximaltubuleepithelialcells；Primarycultrue；Rat肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭终末期的共同表现，肌成纤维细胞在此过程中发挥重要作用。目前，肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化是纤维化过程中成纤维细胞和肌成纤维细胞的来源之一〔1）。因此，建立良好的近端肾小管上皮细胞的体

5、外培养模型，对于肾小管上皮细胞疾病的研究十分重要，本实验旨在探讨的方法。1材料与方法主要材料、试剂体重180〜220g的雄性Wistar大鼠（吉林大学基础医学院实验动物中心）；I型胶原酶（Sigma）;优级胎牛血清(Hyclone);DMEM/F12培养基(Gibco);细胞角蛋白18(CK18)多克隆抗体(北京博奥森公司)；SP试剂盒、DAB试剂盒(福州迈新公司)。肾小管上皮细胞的分离培养大鼠实验前12h禁食，自由进水。颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5min,无菌取双肾，置于冷中，去除肾蒂及包膜，切取薄层肾皮质，剪碎至lmm3大小，PBS洗3遍，离心800r/min，5min;所得沉淀加入

6、终浓度为lg/L的I型胶原酶，37°C振荡消化30min，将消化后的组织碎块转移至80目不锈钢网上，过滤、研磨并用DMEM/F12培养基冲洗；网下液体再经200目筛网过滤后，1000r/min离心5min。取沉淀用45%Percoll分离液25ml重悬制备细胞悬液。将细胞悬液小心铺于含5mll00%Percoll分离液的离心管中，14000r/min，4°C条件下离心25min可见液体分层。吸取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管节段及其游离的上皮细胞。DMEM/F12培养1000r/min，10min离心液洗除残留的Percoll分离液。将分离的近端肾小管上皮细胞用含10%胎牛血清的DME

7、M/H2培养液重悬后接种于培养皿中，于37°C，5%C02孵箱中静置培养，隔天换液。原代培养4〜5d后细胞长满，％胰蛋白酶(含%EDTA)消化，待细胞变圆后弃胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化并传代，继续培养。近端肾小管上皮细胞的鉴定倒置显微镜下观察培养细胞的形状及生长情况。免疫细胞化学染色：制备细胞爬片，定后以CK18抗体为一抗，SP法进行免疫细胞化学染色，二抗为羊抗鼠/兔IgG，阴