大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法的论文

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1、大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法的论文【摘要】目的：以doucet介绍的方法为基础，改良了测定大鼠肾脏近端小管na+k+atpase活性的方法。方法：首先，利用自制的玻璃分针能准确而迅速的分离获取近端小管；其次，使用传导性能较好和易于折叠的锡箔纸代替了铝片，简化了孵育和测定过程。结果：改良方法与doucet建立的经典方法比较，测定结果无显著性差异(p＞0.05)；但对小管长度确定平均耗时和转移含32p的孵育液平均耗时明显降低。结论：本文介绍的测定大鼠肾脏近端小管na+k+atpase活性的改良方法，减少操作步骤，缩短了操作时间和暴露在

2、放射性环境中的时间；简化并改进了操作条件，降低了实验要求和成本。【关键词】近球小管;钠泵;活性测定;改良方法;大鼠肾小管基底膜上的钠泵，是肾脏实现其功能作用的关键酶，测定该酶的活性，对不同状况下肾脏的功能研究具有重要的意义。测定单根肾小管钠泵活性的方法，doucet首先于1979年进行了较为详细的报道[1]（简称doucet法），该方法目前仍是测定肾小管钠泵活性的最精确最常用的方法，特别是测定不同节段肾小管的钠泵活性[2]。过去的二十多年，doucet法得到了一些改进[3,4]，但是改进并不显著。doucet法的技术要求高，准备与操作过程都比较复杂耗

3、时，与32p接触时间较长，而该物质放射性相对较强，国内大多数实验室都不便开展，造成此项研究工作在国内的几近空白。.改良doucet法（简称改良法），即在不影响测定结果的情况下，简化操作条件及步骤，降低物耗和时耗，使它适用于国内一般实验室，就显得十分必要和迫切。1材料1.1实验动物雄性a）。[γ32p]atp(北京福瑞特公司)。xtj5400体视显微镜（广西梧州光学仪器厂），配套显像系统购自日本unican公司。sn6930a型液体闪烁计数器(上海核所日环公司)。基础分离液、液闪液及钠泵活性测定液的配制参照doucet1990年报告的方法[2]。

4、2实验方法选取10只大鼠，平均分为2组，分别用于doucet法和改良法测定小管的钠泵活性，改良法实验方法如下：2.1单根肾近球小管的分离实验大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg·kg-1，ip）麻醉后，右侧位固定于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤，暴露肾脏，分离腹主动脉，结扎除左肾动脉以外的分支，经腹主动脉插管灌注左肾，先用1ml1%肝素钠溶液，接着用1ml0～4℃含0.2%胶原酶的分离液灌注。灌注后迅速切下左肾，除去肾包膜和肾蒂结构，置于洁净玻片上（玻片下放置低温冰袋）。用剃须刀片，将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.5～1.0mm厚的薄片。将大约10片肾组织放入一

5、容积为2ml的离心管中，管内预先装有1ml含0.15%胶原酶的分离液并预热至37℃，恒温水浴槽中孵育15～20min，持续充入95%的o2和5%co2的混合气体。孵育完毕用2ml含0.05%牛血清白蛋白的分离液漂洗3～4次，0～4℃保存并于30min内完成分离。吸取0.1ml含肾小管组织的分离液到细菌学载玻片的中央凹处，在体视镜载物台上放置一个直径为90mm培养皿，内装洁净冰水和碎冰块，在培养皿内放置一个合适铝架，载玻片平放在铝架上，使玻片底部刚好与冰水接触（提供0～4℃的分离环境），用微分离针分离小管。辨认近球小管是根据它与肾小球、肾小囊、入球小动

6、脉和其它肾小管节段的解剖关系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片，根据放大倍率确定小管长度。2.2单根肾近球小管钠泵活性测定将0.5×0.5cm大小的锡箔纸15片紧贴在铝合金属盘内，纸片中央滴加5μl分离液，10根分离的单根小管分别转移到其中10片纸片上的分离液中，5片不含小管的作空白对照。分别用5μl蒸馏水代替小管周围等渗液，用保鲜膜密封金属盘，4℃，15min后，重新用5μl蒸馏水替换。随后，将密封金属盘直接与－80℃的超低温冰袋接触使其快速冰冻，然后将金属盘放置在0～4℃的冰箱内，待其逐渐融化后，含小管的10张锡箔纸片随机分成两组

7、，分别滴加1μl测定总atp酶或mg2+atp酶活性的孵育液。将金属盘密封后放入37℃水育箱，孵育15min后将金属盘移到碎冰上，分别加入5μl5%冷三氯醋酸终止反应。分别将锡箔纸连同反应液转移到含有2ml10%活性炭悬液的试管中，混匀后离心沉淀（2500rpm，10min），取上清500μl直接放入含5ml液闪液的计数瓶，将液闪瓶放入液体闪烁计数器中，静止3小时，测定各样本cpm值。采用doucet建立的公式计算，钠泵活性用单位长度小管单位时间水解atp释放无机磷的数量来表示（pmol·mm-1·h-1），即以酶促反应速度表示酶的活性。3结果3.

8、1微分离小管的结果图片见图1，a表示转移后的单根肾近球小管节段；b表示微分离的近球小管电镜图象。电镜下可见近