促性腺激素释放激素对大鼠胰腺细胞内camp含量的影响论文

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1、促性腺激素释放激素对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响论文曹宏伟,蒲若蕾,黄威权,姚兵,陈蕾,张荣庆,姬秋和【摘要】目的：通过观察GnRH类似物（GnRHR激动剂和拮抗剂）对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响，了解cAMP在GnRHR介导的信号转导通路中的作用.方法：以不同浓度GnRH类似物对原代培养的大鼠胰腺细胞进行刺激，借助放免法测定观察在体外条件下GnRH类似物对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响.结果：在量效实验中，各浓度GnRHR激动剂均能使细胞内cAMP含量增加，其中10-8～10-5mol/L中4个浓度组最为明显，与对照组相比有非

2、常显著差异（P0.01）.应用GnRHR拮抗剂（10-6mol/L）后明显抑制了激动剂组增高cAMP含量的作用，其cAMP水平与对照组比较没有显著差异（P0.05）.在时效实验中，应用10-7mol/LGnRHR激动剂刺激细胞.freelin起细胞内cAMP含量即开始增多，到1h达到峰值，以后逐渐下降，8h后恢复到原水平.结论：由以上结果推测cAMP可能是GnRHR介导的信号转导通路中的信号分子之一.【关键词】大鼠；胰腺；促性腺激素释放激素受体；信号转导；环磷酸腺苷【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofst

3、imulatorsandblockersofgonadotropinreleasinghormone(GnRH)receptorsoncAMPproductionbyratpancreaticcellsinvitro.METHODS:CellcultureandradioimmunoassayediasupplementedulatecAMPproductioninaconcentrationdependentmannerfrom10-8to10-5mol/L,ol/L，P0.01).ThecAMPproductioncouldbest

4、imulatedbytheGnRHagonist(10-6mol/L)inatimedependentmanner,ulationandreturnedtoitsoriginallevelat8hlater.CONCLUSION：cAMPmaybeoneofthesignalingfactorsinvolvedintheGnRHreceptorssignalingpathonereceptor(GnRHR）；signalingpatha公司）；cAMP放免检测试剂盒（北京中国原子能研究院同位素研究所）；当日生同窝SD大鼠（北京维科利华

5、实验动物中心）.1.2方法1.2.1大鼠胰腺腺泡细胞的原代培养将等体积胰酶与胶原酶混合成细胞分离液，预热至37℃待用.乳鼠行颈椎脱臼法处死，75mL/L酒精溶液中消毒3～5min，移入超净台，剖腹，无菌条件下取胰腺组织，放入4℃Hanks液中；小心去除被膜及脂肪组织，用弯头眼科剪将其剪成1mm3左右的碎块；将5mL预热的细胞分离液移入25mL锥形瓶中，37℃下消化15min（其间摇动数次）；待大块组织沉降后，40μm筛网过滤.用新鲜的细胞分离液重复以上步骤2次，收集滤液，离心后重新悬浮于10mLHanks液中.在另外两个离心管中加入35m

6、LBSA，每管溶液上轻轻移入5mL细胞悬液，100g离心5min，弃上清.重复以上步骤两次.悬浮细胞于1640培养液中，接种于25cm2培养瓶，放入体积分数50mL/LCO2，37℃培养箱内培养30min，把培养液倒入另一培养瓶，其中即为较纯的上皮样细胞；隔日换液，利用时差贴壁法进行纯化，直至成纤维样细胞被去除.1.2.2细胞分组施加刺激因素纯化的胰腺腺泡细胞生长状态稳定后，消化分离记数细胞，接种于24孔板；待细胞生长满至孔底时（24h），更换含20mL/L血清的培养液使细胞同步化；不同药物浓度（剂量效应）刺激：分别给予各孔内加入10-9

7、，10-8，10-7，10-6，10-5GnRHagonist，10-7GnRHagonist+10-6GnRHantagonist，孔内不加药物作为对照组；不同药物作用时间（时间效应）刺激（药物浓度：10-7GnRHagonist）：分别给予0，5，10，30，60min，2，4，8，24h作用时间.1.2.3检测样品制备分别按量效和时效实验分组孵育细胞后，吸去药液终止实验；加入冷TE缓冲液冲洗细胞，然后用细胞刮子刮下细胞，分别收集到玻璃试管中，按分组标记好；每管加入1mLTE缓冲液，吹散细胞，100℃水浴5min；冰上冷却；4℃300

8、0g离心15min，取上清标于Ep管标记待测.1.2.4cAMP活性检测(1)cAMP标准液配制：取试剂盒中标准cAMP1瓶（内含cAMP320pmol），加TE缓冲液800μL溶解成400p