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时间:2018-11-15
《大鼠胰腺促性腺激素释放激素受体mrna的原位杂交》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、大鼠胰腺促性腺激素释放激素受体mRNA的原位杂交 摘要:目的研究大鼠胰腺促性腺激素释放激素(GnRH)受体mRNA的存在及细胞定位.方法采用原位杂交组织化学法.结果胰脏的外分泌部腺上皮细胞、胰导管上皮细胞及内分泌部胰岛细胞内均可检测到较强的GnRH受体mRNA杂交信号.杂交阳性信号物质均分布在胞质内,胞核呈阴性.结论大鼠胰脏内、外分泌部均能合成GnRH受体.GnRH也是一种消化激素,它由胰脏自身合成,又作用于胰脏,可能参与胰脏内、外分泌功能的调节. Abstract:AIMTostudyonereceptor(GnRHR)mRNAexistsinratpancreasandi
2、tscellularlocalization.METHODSInsituhybridiza-tionRNAhybridizationsignals.Thesignalsdistributedincytoplasmofallpositivecellsoneproducedbypan-creaandisresponsibleformodulatingtheexocrineanden-docrinefunction. 0引言 许多研究已经证明促性腺激素释放激素(GnRH)及其受体存在于下丘脑-垂体轴以外的器官[1],我们先前的研究也已报道了胃肠胰系统能自身合成GnRH[2,3],而
3、且证实胃肠胰系统及颌下腺均含有GnRH受体免疫反应阳性物质[4,5].我们采用原位杂交法,观察大鼠胰脏是否存在GnRH受体mRNA,旨在从转录水平证明胰脏自身能合成GnRH受体,并提出GnRH也是消化激素,可能参与胰脏的内、外分泌功能的调节. 1材料和方法 1.1材料地高辛标记的GnRH受体cDNA寡核苷酸探针由大连宝生物生物工程有限公司合成.敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(碱性磷酸酶)为武汉博士德生物工程公司产品.雄性SD大鼠3只,体质量200~250g,断颈处死打开腹腔,取出胰脏置Bouin液中室温固定过夜,按石蜡包埋程序将胰脏组织包埋于蜡块内,在严格限制RNA酶污染的
4、条件下切成6μm厚的切片,贴于预先涂有APES的载玻片上. 1.2方法探针的制备参照大鼠脑垂体GnRH受体cDNA序列设计而成[6],序列如下:5’-ATGTAT-GCCCCAGCCTTCATGATGGTGGTGATTAGCC-TGGATC-3’,经大连宝生物公司合成并在5’端作地高辛标记.切片经脱蜡水化后,经3g・L-1H2O2-甲醇室温处理30min,蒸馏水洗涤3次,0.5mol・L-1TBS(pH7.3)1∶200稀释的proteinaseK于37℃消化20min,40g・L-1多聚甲醛5min,蒸馏水洗5min,3次,切片空气干
5、燥后,每张切片滴加含2.0mg・L-1标记探针的原位杂交液20μL,置湿盒中于42℃杂交18h,2×SSC室温洗涤5min,3次,0.1×SSC洗涤10min,2次,滴加封闭液置室温20min,不洗,滴加小鼠抗地高辛抗体置室温孵育2h,0.5mol・L-1TBS洗5min×3次,滴加生物素化羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h,0.5mol・L-1TBS洗5min,3次,滴加SABC-AP于37℃孵育30min,0.5mol・L-1TBS洗5min,3次,最后用BCIP/NBT显色液于室温显色20~30min,水洗中止反应,梯度乙
6、醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片.阴性对照作如下设置:将切片用RNA酶进行预处理后杂交;用不含探针的杂交液进行杂交;用正常小鼠血清取代小鼠抗地高辛抗体进行孵育. 图1-图5略 2结果 GnRH受体mRNA杂交信号呈蓝色,背底不着色,反差明显,阳性细胞易于识别.3种阴性对照试验均呈阴性反应. 胰脏的周边部分GnRH受体mRNA杂交反应信号较强,中央部分杂交信号较弱(Fig1),周边部分外分泌部的全部腺上皮细胞均可检到很强的GnRH受体mRNA杂交反应信号,信号物质分布于胞质,核呈阴性(Fig2).胰脏的中央部分外分泌部只有部分腺上皮细胞可检到GnRH受体mRNA杂交信号,这
7、些细胞散在分布,杂交信号物质分布于胞质,核呈阴性(Fig3).胰脏外分泌部的导管上皮细胞也可检测到GnRH受体mRNA杂交反应信号,信号物质也分布于胞质内,核呈阴性(Fig4).胰岛细胞中也可检到GnRH受体mRNA杂交信号,这些细胞呈团、呈索散在分布于胰岛内,信号物质也分布在胞质内,胞核为阴性反应(Fig5). 3讨论 GnRH受体由327个氨基酸构成,有7个跨膜结构域,属G蛋白偶联受体,哺乳类脑垂体性腺细胞上的GnRH受体和GnRH的结合有高度特异性,光亲和标记、层析电泳
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