重组信号分子grf的ph结构域抑制蛋白激酶c活性论文

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1、重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性论文.freelology（PH）结构域与谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的可溶性，并进一步检测该重组蛋白与蛋白激酶C（PKC）的结合及对PKC活性的影响.方法将表达GRF的PH结构域与GST融合蛋白的菌体经超声裂解，上清中的融合蛋白用琼脂糖珠锚定纯化.Toinvestigateassociationofguanine-nu-cleotide-releasingfactorforRas（GRF）PHdomainandpro-teinkinaseC（PK

2、C）andtoexamineeffectofGRFPHdo-mainonactivityofproteinkinaseC.METHODSGRFPHdomain-GSTfusionproteinail.jishaopinghotmail.teinployedtoconfirmthebindingofthePHdomainined.RESULTSAssociationofPKCainaindoainbindstoPKCandinhibitsitskinaseactivityinvitro.0引言我们以前

3、克隆表达了GRF（guanine-nucleotide-releasingfactorforRas）的PH结构域［1］，现进一步研究其与PKC间的相互调节关系.GRF属小G蛋白家族，大鼠GRF由1244个氨基酸构成，其中包括两个PH结构域，分别位于22～129位和452～580位氨基酸［2］.Ras蛋白是多种信号转导途径的核心.许多受体信号经过一系列的细胞内转导，在小G蛋白家族的介导下使GTP与Ras蛋白结合并激活Ras，从而启动Ras-Raf-MAPK信号系统［3］.当用Ras抗体或将Ras突变可

4、明显阻断这些受体所介导的功能.在这一过程中，GTP与Ras蛋白结合可由GRF催化［2］.另一方面，GRF能刺激GDP与Ras的解离，促使GTP与Ras的结合.将GRF和Ras共表达于COS7细胞，可检测到GTP结合形式Ras的聚集［4］.目前，有关GRF与PKC之间相互作用我们所知甚少.对于MAPK信号转导途径的许多信号是经由Ras向下传递的，已知GRF能催化GDP-Ras转变成GTP-Ras形式从而激活Ras，这其中除了GRF外，SOS-1对Ras也具有激活作用.在许多信号转导途径中处于重要位置的

5、PKC，其介导的信号转导通路可看作是不同于MAPK信号途径的另一信号转导通路，但研究却发现PKC也对Ras有激活作用［5］.与GRF及SOS-1相比，PKC对Ras的激活方式以及激活后的效应是不同的［6］.有关PKC对GRF的激活机制尚有待进一步研究.1材料和方法1.1材料中分子质量蛋白质分子质量参照物购自华美公司，蛋白酶抑制剂购自Promega公司，其他试剂盒的来源在随后注明.PGEX-4T-1载体和DH5α菌株为本教研室保存.1.2表达蛋白的可溶性鉴定及纯化以超声波破碎已表达GRFPH结构域-R

6、ST融合蛋白的菌体，4℃，2×1min.离心（12000g，4℃20min）.分别取50μL上清（留上清备用）和全部沉淀（沉淀约占总体积的1%～2%），加入2×上样缓冲液50μL，按常规方法进行SDS-PAGE.将上清，以谷胱甘肽偶联的琼脂糖珠纯化所表达的融合蛋白，多次离心漂洗后取沉淀.通过SDS-PAGE，调整各组蛋白质的浓度（以电泳后蛋白质条带的粗细为参照，用宿主菌上清作稀释液），使之接近一致，以避免非特异结合造成的差异.1.3Jurkat细胞的培养及裂解将人T细胞白血病细胞系Jurkat接种于

7、RPMI1640培养基（含100mLL-1的胎牛血清），于37℃50mLL-1CO2条件下培养.收集细胞（约2×107），加入2mLNP-40细胞裂解液（10gL-1NP-40，20mmolL-1Tris-HCl，pH8.0，150mmolL-1NaCl，0.2gL-1NaN3，0.1mmolL-1CaCl2，用前加入0.17gL-1aprotinin，1.0mmolL-1PMSF），震荡1min，离心（14000g，4℃，10min），取上清于4℃备用.1.4APK信号转导系统的许多信号是必须经由

8、Ras向下传递，Ras在这一系统中处于重要地位.已知GRF能催化GDP-Ras转变成GTP-Ras形式从而激活Ras［8］，这一过程，除了GRF外，SOS-1和Vav等对Ras也具有激活作用，这些分子均参与了对Ras-Raf-MAPK信号转导系统的调节.在许多信号转导途径中处于重要位置的PKC［9，10］，是一类胞质内丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛参与细胞的多种生命过程，包括生长、分化、细胞周期调节、肿瘤发生、细胞凋亡、T细胞的免疫过程以及学习和记忆等.其介导的信号转导通路