电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区皮层神经生长因子表达的影响论文

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1、电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区皮层神经生长因子表达的影响论文易玮，许能贵，汪帼斌，佘世锋，徐振华，赖新生【关键词】脑缺血／针灸疗法；,,神经生长因子／针灸效应；,,百会,穴；,,大椎,穴；,,疾病模型,动物；,,.freelol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；体积分数为3%的Ｈ２Ｏ２；牛血清白蛋白(BSA)；二氨基联苯胺(DBA)；聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX１００）；第一抗体为羊抗大鼠NGF抗体(Chemicon公司产品，购于深圳晶美公司)；生物素标记的第二抗体为兔抗羊IgG(Chemicon公司产品，购于深圳晶美公司)；普通光学显微镜(×４００）；３０号1寸毫针(华佗牌

2、，苏州医疗用品厂生产)；G?6805１电针治疗仪(青岛华青仪器厂)。13模型复制采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血(MACO)模型［４］。具体方法是用100?g/L水合氯醛溶液，按400?mg/kg剂量腹腔麻醉；取右上侧卧位固定，沿耳眼连线中点切开皮肤，分离颞肌，暴露颞骨作一骨窗，轻抬脑，显露大脑中动脉，用烧红的不锈钢丝轻触大脑中动脉，使之凝闭，复制局灶性脑缺血模型；其中假手术者只作手术暴露大鼠大脑中动脉，不予凝闭；电针组立即给予电针治疗。14治疗方法141穴位选择穴位选取督脉经的百会、大椎2穴，其定位参照大鼠的常用针灸穴位［５］：“百会”位于顶骨正中；“大椎”在第7颈

3、椎与第1胸椎间，背部正中。142刺法电针组大鼠以30号1寸毫针斜刺百会05寸(同身寸)，直刺大椎05寸，将针柄分别连接至电针仪上，5～10?Ｈz，疏密波，强度以大鼠安静耐受为度，一般3～5?V，时间30?min。每天1次，均在上午10点左右进行，分别连续治疗2周(2周组)和5周(5周组)。假手术组和缺血模型组大鼠只在同等条件下饲养，未予任何处理。15标本采集及处理2周及5周后，分别取出大鼠，100?g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏快速灌流生理盐水100?mL，然后用40?g/L多聚甲醛(4℃)灌流固定30?min；断头取脑，放入40?g/L多聚甲醛进行后固定4～6?h，然后

4、分别置于150、200、300?g/L的梯度蔗糖脱水；待脑组织下沉后取出做冰冻切片，片厚40?μm，取缺血中心的脑片(前囟前01～08?mm)进行免疫组织化学染色。16免疫组织化学染色切片入001?mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH72～74)漂洗3次，每次5?min；再入体积分数为3%的Ｈ２Ｏ２中漂洗10?min，然后放入含10?g/LBSA和2?g/LTritonX１００的PBS溶液中20?min，将切片放入稀释后的第一抗体中，37℃孵育2?h，移入4℃冰箱孵育30?h；经PBS漂洗3次，切片入生物素标记的第二抗体，37℃孵育1?h，PBS漂洗3次；切片挑入05?g/

5、LDAB(含体积分数为010%的Ｈ２Ｏ２）中，显色后入PBS漂洗3次，贴片，晾干，梯度酒精脱水后晾干，入二甲苯溶液2次，每次各5?min，苏木素复染，最后多聚树胶封片。对照实验以正常羊血清和PBS代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。17细胞计数及统计光镜下(×４００）对假手术组、缺血模型组和电针组手术侧皮层的免疫阳性细胞进行计数，每组计算18张切片、每张切片计算3个非重叠视野的免疫阳性细胞数目，并进行方差分析检验。2结果NGF的免疫阳性颗粒分布在神经元胞浆内，两个假手术组大鼠手术侧皮层只见到很少的NGF免疫阳性细胞。两个缺血模型组(2周组和5周组)大鼠脑缺血

6、区皮层NGF免疫活性细胞表达明显增多，与假手术组比较具有显著性差异（Ｐ＜００１）；缺血5周组与缺血2周组相比，缺血区皮层NGF阳性细胞的数量下降（Ｐ＜００１）。电针组在2周时缺血区皮层NGF免疫阳性细胞的表达增高，与缺血2周组及假手术2周组比较具有显著性差异（Ｐ＜００１）；电针5周组大鼠缺血区皮层NGF免疫阳性细胞表达虽呈下降趋势，仍高于同时间段的缺血组大鼠（Ｐ＜００１）。结果见表1、图1。表1电针对MACO模型大鼠脑缺血灶周围皮层NGF阳性细胞数的影响3讨论神经生长因子(NGF)是LeviMontalcini等于20世纪50年代发现的第1个神经营养因子。自20世纪80年代

7、中期发现脑内存在NGF的mRNA、蛋白及NGF受体以来，NGF与中枢神经系统(S)疾病的关系及运用NGF防治S疾病的研究就越来越广泛和深入。在生理情况下，NGF在脑内的含量高低依次为海马、大脑皮质、嗅球、基底前脑、小脑、纹状体［６］。NGF在脑内含量虽微，但在神经系统内对神经元的生存、分化、生长起着重要作用，特别在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用。研究表明，NGF能抑制中枢神经元因缺血而导致的程序性细胞死亡，增加自由基清除剂的活性，减轻缺血神经细胞损伤，促进受损神经元的再生［３］。NGF能促进脑缺血后运