活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子mrna表达的影响

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1、活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子mRNA表达的影响【摘要】目的观察活血熄风方对局灶性脑缺血模型大鼠脑梗塞体积及脑组织中血管内皮生长因子（VEGFmRNA）表达的影响。方法ethodsarkerDL2000、Taq酶、Ribonucleaseinhibitor、dNTPMixture（大连宝生物）；M-MLVReverseTranscriptase（美国Promega）；玫瑰红(美国Sigma)；红四氮唑(TTC)（化学纯，北京化工厂）。　　梯度PCR系统（ICYCLER型，美国BIO-RAD公司）；DXY-2稳压稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂

2、）；凝胶成像系统（GelDoc2000型，美国BIO-RAD公司）；低温高速离心机（Sigma3k30，德国Sigma公司）；紫外分光光度仪（UV-1601型，日本岛津）；立体定位仪（美国Stoelting公司）；IPP图像采集分析系统（美国）。　　2方法　　2.1分组与给药大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、活血熄风方高剂量组、活血熄风方中剂量组、活血熄风低剂量组、尼莫地平对照组，每组12只，其中6只用于TTC染色，6只用于RT-PCR。各组均给予手术造模，假手术组股静脉注射药物为生理盐水，其余操作同模型组。各组造模前7d灌胃给药，活血熄风方高、中、低剂量

3、组分别给予活血熄风方20，10，5g·kg-1·d-1，对照组给予尼莫地平0.02g·kg-1·d-1，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，末次给药1h后造模。　　2.2局灶性脑缺血性大鼠模型的制备采用光化学法诱导制备局灶性脑缺血性大鼠模型，根据-MLV催化合成cDNA。VEGFmRNA和内参照酸性核糖体磷蛋白P0(AcidicribosomalprotEinP0，Arbp)引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下：VEGF：5-TGGACCCTGGCTTTACTGCTG-3（上游），5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA-3

4、（下游），扩增片段为127bp；Arbp：5-GCGTCTGTCTGCAGATTGGCTA-3'(上游)，5-CAGATGGATCGGCCAGGAA-3(下游)，扩增片段为150bp。采用50μl反应体系进行扩增，反应参数为：Arbp95℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s×30个循环，72℃终末延伸4min。VEGF：95℃4min，94℃30s，60℃30s，72℃20s×35个循环；72℃终末延伸7min。　　2.4.3半定量分析扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，在电压为5V·cm-1及稳流的条件下进行电泳，用QuantityOne分析软

5、件进行光密度扫描，测定各组PCR产物密度值与内参照ArbpPCR产物密度值。用各组目的基因片段（VEGF）密度值/内参基因片段（Arbp）密度值的比值进行比较。　　2.5统计学方法应用　　SPSS13.0统计软件进行统计处理，所有数据均用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，成组数据比较采用t检验，以P＜0.05为具有统计学意义。　　3结果　　3.1活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响大鼠脑组织经TTC染色后，除假手术组外均在照射区大脑皮层出现白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，边界清晰，冠状面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，表明造模成功。

6、活血熄风方各剂量组及尼莫地平组脑梗塞灶体积均较模型组减小，统计学差异显著(P＜0.01)。活血熄风方各剂量组与尼莫地平对照组比较，无明显差异（P＞0.05）。结果见表1，图1。表1活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响（略）　　3.2活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织VEGFmRNA表达的影响与假手术组比较，模型组VEGFmRNA表达有所升高（P＜0.01）。与模型组比较，活血熄风方各剂量组与尼莫地平组均可显著上调脑组织VEGFmRNA的表达（P＜0.01），且活血熄风方各剂量组VEGFmRNA表达相对含量均明显高于尼莫地平对照组（P＜0.01）。见表

7、2，图2。表2对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞边缘区VEGFmRNA表达的影响（略）　　4讨论在缺血性脑血管疾病的研究中人们注意到，VEGF及其受体的促血管形成作用对缺血半暗区血供的改善和侧枝循环的建立具有重要意义。VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖，提高血管通透性等生物学特性。脑缺血后，低氧可激活VEGF及其受体系统，促使缺血半暗区VEGF表达，VEGF诱导大量新生血管形成，促进血管增生，增加受累组织的血流灌注和供氧量，减少神经元的凋亡和死亡，减轻脑损伤程度［6］。目前发现VEGF主要有Flkl和Flt两个特异性受体，其中Flkl是发挥生物

8、活性的主要受体［7］，VEGF与其受体结合后在血管生