白背叶根抗乙型肝炎病毒的体外实验研究论文

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1、白背叶根抗乙型肝炎病毒的体外实验研究论文张晓刚，吕志平，谭秦湘，钟小兰【关键词】白背叶根；抗乙型肝炎病毒；,,,HepG2.2.15细胞摘要：目的观察白背叶根体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法以HepG2.2.15细胞株为模型，用微粒酶免疫测定技术（MEIA）检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR荧光定量技术检测细胞上培养上清液中HBVDNA的变化，以MTT比色法观察药物的细胞毒性。结果白背叶根对HepG2.2.15细胞的TC50为48.25mg/ml，对抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13.26和43.08。对HBVDNA仅有

2、微弱抑制作用。结论白背叶根在体外细胞培养中具有直接抗HBV活性。关键词：白背叶根；抗乙型肝炎病毒；HepG2.2.15细胞白背叶根为大戟科野桐属植物白揪的根.freell，以8层细纱布粗滤后，经1500r/min离心10min，上清液再用定性过滤液纸粗滤，25℃下测pH值为5.09，调节pH值为7.09，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放备用。干扰素α1b（赛若金）由深圳科兴生物工程股份有限公司提供，10万IU/支（实验用药）。1.2细胞培养HepG2.2.15细胞来自南方医科大学（原第一军医大学）全军病毒性肝炎重点实验室。将HepG2.2.15细胞接种于DMEM混合培养液（含

3、20%胎牛血清、0.03%L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、380μg/mlG418），置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。换液1次/3d，6~10d传代。每次换液留取上清，检测HBVDNA分泌情况，表达稳定后开始实验。1.3药物对HepG2.2.15细胞的毒性实验根据SargentJM等［3］建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。将白背叶根提取液用DMEM混合培养液分别稀释成1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96mg/ml和1000，500，250，125，62.5，

4、31.25，15.63，7.82，3.91，1.96μg/ml等20个实验浓度，培养细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0.1ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，于48h后换入不同浓度含药DMEM混合培养液，同时设无药物细胞对照组，每浓度4孔，每4天换新鲜含药培养液，共2次。第8天每孔加入MTT溶液（1mg/ml）200μl，继续在37℃下孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清，然后每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，置入酶联检测仪中以570nm波长测定各孔光吸收值（OD值），重复3次，依照ReedMuench

5、法［4］计算药物对HepG2.2.15细胞的抑制百分率（%）=（细胞对照组平均A组-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值×100%；细胞半数有毒浓度（TC50）=Antilg［lgB+(50-B)的抑制百分率/（A-B）的抑制百分率）×C］×100%，治疗指数（TI）=半数有毒浓度（TC50）/半数有效浓度（IC50）。TI＞2为有效低毒，1＜TI＞2为低效低毒，TI＜2为毒性作用。注：A=lg＞50%药物浓度，B=lg＜50%药物浓度，C=lg稀释倍数。1.4药物应用培养细胞用胰岛蛋白酶化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于24孔培养孔，每孔1ml，37℃、饱和湿度、5%CO

6、2培养，根据药物毒性度验结果，于48h后换入6种不同浓度（31.25，15.63，7.82，3.91，1.96，0.98mg/ml）的细胞全培养液，阳性对照药物为干扰素α1b（赛若金100，200，400IU），同时设不含药物的细胞对照组。每4天换新鲜含药培养液，共2次，于第4，8天留取培养液作为检测标本-20℃保存，同批次试剂同一时间检测。1.5上清液中HBsAg，HBeAg的检测采用微粒酶免疫（MEIA）测定技术（美国Abbott公司AXSYM全自动免疫分析系统及试剂盒）检测，结果以S/CO值表示。抑制率=（细胞对照组S/CO值-药物组S/CO值）/细胞对照组/S/CO值×100%。1

7、.6上清液中HBVDNA的提取及定量检测采用PCR荧光定量技术检测上清液中HBVDNA定量。每个浓度重复测定3次，取平均值。HBVDNA抑制百分率（%）=（细胞对照组平均A值-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值×100%。1.7统计学分析结果用±s表示，组间比较用方差分析，采用SPSS11.0完成。2结果2.1白背叶根的细胞毒性实验结果显示，不同浓度的白背叶根对HepG22.2.15细胞均有不同程度的毒性作用，随着药物