myostatin干扰质粒的构建及在c2c12细胞中的效果验证

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1、Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证吴欣，邵晨昕，顾芸，丁斐，刘梅【摘要】目的：研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法：根据MyostatinmRNA序列，选择3个19nts的靶序列，设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链，退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体，构建3个RNAi阳性质粒：M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSil

2、encer并转染C2C12细胞，采用实时荧光定量PCR和yostatinmRNA和蛋白表达的下调作用。结果：构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量，随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加，Myostatin表达量逐渐降低。结论：成功构建MyostatinRNAi质粒，该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。【关键词】Myostatin；RNA干扰；C2C12[Abstract]Objective：Toeval

3、uatetheroleofRNAinterference(RNAi)insilencingMyostatinexpressioninmouseC2C12cells(myoblast).Methods：ThreetargetsequencesandanegativesequenceRNAsequence，theplementaryDNAcontainedbothsenseandantisenseoligonueleotidesidsnamedM1/pSilencer,M2/pSilencer,M3/pS

4、ilencer,andthenagetiveplasmidnamedMc/pSilencerePCRand1/pSilencercouldreduceMyostatinexpressionsignificantly.1/pSilencerincreasing,theexpressionofMyostatinandmRNAdecreased.Conclusion：TheresultsindicatedthatMyostatinRNAiplasmidsidscouldreduceMyostatinexpr

5、essioninC2C12cells.[KeyRNA和蛋白具有特定的表达模式[8，9]，提示Myostatin在失神经性肌萎缩过程中扮演重要角色。为了进一步探讨Myostatin在失神经肌萎缩中的生物学作用，本实验构建小鼠MyostatinRNAi质粒，采用yostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。1材料和方法1.1细胞及主要试剂C2C12细胞株，购自北京军事医学科学院。DMEM，Lipofectamin2000（Invitrogen），胰蛋白酶（Sigma），胎牛血清

6、（杭州四季青有限公司），pSilencer2.1-U6表达载体（Ambion公司），限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ（TaKaRa公司），细胞蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒（上海申能博采生物科技有限公司），兔抗小鼠Myostatin多抗（Chemicon），IRDye800偶联的驴抗兔及驴抗羊IgG（HL,Rockland,USA），羊抗小鼠GAPDH多抗（SantaCrus）。1.2C2C12细胞的培养C2C12细胞接种于含DMEM完全培养基（10％胎牛血清）的培养皿中，置于5％C

7、O2、饱和湿度、37℃培养箱内培养。2天换液1次。实验所用的细胞均处于对数生长期。1.3MyostatinRNAi质粒构建根据小鼠MyostatinmRNA序列（注册号为NM_010834）获得3对来自Ambion公司的siRNA序列信息，按ID#156380的序列，将碱基序列重排，经GenBankBLAST检索，不与小鼠任何基因同源，作为阴性对照的序列（表1），根据发夹siRNA的构成方式，设计siRNA模板，包含各正反义靶序列的互补DNA链、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ识别序列（表2），上述

8、4对RNAi序列由上海鼎安生物科技有限公司合成。用TE溶解siRNA模板寡核苷酸，浓度至1μg/μl。SiRNA模板核苷酸的退火：反应在灭菌的0.5ml离心管中进行，依次加入：sensesiRNA模板核苷酸2μl，antisensesiRNA模板核苷酸2μl，2×DNAAnnealingSolution25μl，反应总体系50μl，轻轻混匀，稍加离心。90℃3min后，37℃1h，退火的siRNA模板链-20℃保存备用。将5μl模板链加入45μl双蒸水中