myostatin干扰质粒的构建及在c2c12细胞中的效果验证

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1、Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证作者：吴欣，邵晨昕，顾芸，丁斐，刘梅【摘要】目的：研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法：根据MyostatinmRNA序列，选择3个19nts的靶序列，设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链，退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体，构建3个RNAi阳性质粒：M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSilencer并转染C2C12细胞，采

2、用实时荧光定量PCR和Westernblot观察RNAi对C2C12细胞中MyostatinmRNA和蛋白表达的下调作用。结果：构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量，随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加，Myostatin表达量逐渐降低。结论：成功构建MyostatinRNAi质粒，该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。【关键词】Myostatin；RNA干扰；C2C12[Abstract]Objective：Toevaluatetherol

3、eofRNAinterference(RNAi)insilencingMyostatinexpressioninmouse12C2C12cells(myoblast).Methods：ThreetargetsequencesandanegativesequencewereselectedaccordingtoMyostatinmRNAsequence，thecomplementaryDNAcontainedbothsenseandantisenseoligonueleotidesweredesignedandsynthesized．Afte

4、rannealing,thedoublestrandsDNAwereligatedtothepSilencer2.1-U6siRNAexpressionvector．ThreepositiveRNAiplasmidsnamedM1/pSilencer,M2/pSilencer,M3/pSilencer,andthenagetiveplasmidnamedMc/pSilencerweretransfectedintotheC2C12cells,inwhichthesilencingeffectonMyostatinexpressionwasi

5、nvestigatedbyreal-timePCRandWesternblot.Results：AmongthethreeRNAipositiveplasmids,theM1/pSilencercouldreduceMyostatinexpressionsignificantly.WiththedoseofplasmidM1/pSilencerincreasing,theexpressionofMyostatinandmRNAdecreased.Conclusion：TheresultsindicatedthatMyostatinRNAip

6、lasmidswereobtained,andtheRNAiplasmidscouldreduceMyostatinexpressioninC2C12cells.[Keywords]Myostatin；RNAi；C2C121997年美国JohnsHopkins大学的研究人员从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出Myostatin。蛋白质同源性比较证明Myostatin是TGF-β12超家族的新成员，又称生长分化因子8。在Myostatin敲除的小鼠体内，肌纤维发生广泛的增生和肥大，导致骨骼肌肌肉质量显著增加[1~4]。Myostatin编码序列发

7、生突变的牛也出现肌肉质量显著增加，呈现“双肌现象”[5，6]。由此可见，Myostatin能抑制骨骼肌的生长，是骨骼肌生长的负性调控因子[3，7]。我们以前的研究表明，在坐骨神经缺损后，失神经支配的腓肠肌MyostatinmRNA和蛋白具有特定的表达模式[8，9]，提示Myostatin在失神经性肌萎缩过程中扮演重要角色。为了进一步探讨Myostatin在失神经肌萎缩中的生物学作用，本实验构建小鼠MyostatinRNAi质粒，采用WesternBlot及荧光定量PCR法，验证Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中

8、的沉默作用。1材料和方法1.1细胞及主要试剂C2C12细胞株，购自北京军事医学科学院。DMEM，Lipofectamin2000（Invitrogen），胰蛋白酶（Sigma），