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时间:2018-11-20
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1、光谱核型分析技术在白血病中的应用【摘要】光谱核型分析技术是近几年建立的一种细胞遗传学检测方法,它可以在没有任何预知的情况下同时对人的24条染色体进行核型分析,可以识别常规显带和单纯应用荧光原位杂交难以精确辨认的一些畸变,具有高度的精确性、敏感性、直观性。本文综述了光谱核型技术的原理及其在白血病中的应用。【关键词】光谱核型分析 ApplicationofSpectralKaryotypinginLeukemia——Reviebiguouslydisplayandidentifyall24humanchromosomesatonetimealitiesinvolved.SKYdiscer
2、nstheaberrationsthatcannotbedetectedveryiacytogeicsosome;karyotype;leukemia自引入染色体显带技术以来,在白血病及其它恶性血液病中发现了大量的重复性畸变,从而使染色体核型检测不仅成为白血病确诊和分型的重要依据,而且作为独立的预后因素之一,对诱导缓解和复发的判断提供了有价值的参考。1997年,-FISH)、彩色显带FISH(Rx-FISH)等技术将染色体分析带入彩色世界。1996年,Schrock等[1]首次报道了SKY技术。这一技术克服了传统FISH只能检测已知位点的异常的缺点,可以在没有任何预知的情况下将人类及小
3、鼠的全部染色体以不同颜色显示出来,因而它可用于染色体的全面筛查,将白血病的细胞遗传学研究引向深入。 SKY技术的基本原理 SKY技术联合应用了光谱干涉仪、频谱遥感连接电荷耦合器件(charge-coupled-device,CCD)和傅立叶变换(fouriertransformation),在可见光和近红外范围去测量所有点的散射光谱,使得多光谱重叠探针得以应用,其成像及分析过程分为三部分。 杂交反应 SKY技术是将人类的24条染色体的涂染探针用5种不同的荧光素或其组合进行不同标记,然后将探针与中期分裂相进行原位杂交,其中SKY应用的涂染探针是流式细胞分选技术分拣出染色体,再经退
4、化低聚寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)扩增获得的。 图像获取 杂交后的标本通过荧光显微镜获得荧光图像并进行光谱成像,其具体过程为由特制光源和滤镜激发所有荧光染料,通过光谱干涉仪,给特定的光谱分配红、绿、蓝3种显示色,又由CCD获取每一个像素的干涉图像,形成一个三维数据库,并得到每个像素的光程差与强度间的对应曲线。由于各条染色体所带有的单个荧光染料不同或组合不同,此曲线经傅立叶变换,再由计算机转换后会获得不同的区分色,这样再分配到每条染色体上,使得24条染色体可以不同颜色区分。 图像分析 经专门的SKY软件分析获得图像。 SKY与M-FISH的比较 1996年,Spich
5、er等[2]报道了另一种以不同颜色描绘人类全部染色体的技术,成为M-FISH。尽管SKY和M-FISH都是在FISH的技术基础上发展的,但这两种技术在原理上是截然不同的。SKY技术是建立在离散光谱测量(在每个像素上以不同波长进行测量强度、频率)的基础之上的,其优点是可以立即并全面鉴定出染色体内的异常,如复杂的重组,易位等,并以不同颜色显示变化后的派生染色体。检测染色体内部重组时,SKY的精确性为500-1500kb[3],当然这也取决于杂交的优劣及分裂相的伸展情况[1,4,5]。 SKY测量的是光谱,因而可以增强多色荧光团的识别力,用光谱核型全面分析获得信息。M-FISH的基本原理是
6、滤镜成像,它是利用5种专门的荧光滤镜,通过CCD相机获得连续的图像,并连续的覆盖这些图像。滤镜对于小数目独立光谱的荧光时,分辨力较为可靠,但对于光谱重叠的染色体进行精确分析时,多滤镜的信号比较低,所以辨认的精确度也要降低。另外,其测量的是光强,易受干扰,特别在染色体的末端辨别力较差,而末端正是白血病染色体检测的重要部位[6]。因而在染色体检测上,总体讲,SKY要优于M-FISH。但SKY也不是完美无缺的技术,它的缺点是难以鉴定染色体内部改变,如一些小的缺失,重复及染色体内的倒位,不能将一些小的染色体片段的来源以可识别的颜色表示出来[7,8],因此SKY技术也有待于进一步发展,并与其它细
7、胞遗传学技术如传统显带,FISH、比较基因组杂交(CGH)等技术互补,以获得最全面的核型[8-12]。 SKY在血液系统肿瘤中的应用 SKY技术问世以来,受到广泛的关注和研究。Veldman等[7]首次应用SKY研究恶性血液病,其中包括7例急性髓系白血病(AML)及骨髓增生异常综合症(MDS)患者。SKY分析证明了常规显带的结果,并发现了未被或未完全被显带鉴定出来的核型。由此证明,SKY可用于细胞遗传学分析,并具有较高的可靠性和敏感性。此后
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