脂氧合酶抑制剂ndga对ht

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1、脂氧合酶抑制剂NDGA对HT作者：夏光涛张源潮武森森张尚忠【摘要】目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA在体外对结肠癌HT29细胞株生长抑制、凋亡影响。方法：应用MTT法绘制生长曲线；倒置相差显微镜观察细胞形态变化；扫描电镜观察细胞的超微结构变化，检测凋亡小体；流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期变化。结果：不同浓度NDGA处理HT29结肠癌细胞，随着药物浓度加大，细胞形态变圆，体积缩小，从瓶壁上逐步脱落，肿瘤细胞凋亡率逐步上升，癌细胞阻滞于G0／G1期。应用扫描电镜可见凋亡小体形成。结论：NDGA对结肠癌HT29细

2、胞具有抑制生长、诱导凋亡作用，凋亡率随药物浓度加大逐步升高。具有剂量依赖效应。【关键词】脂氧合酶抑制剂・结直肠肿瘤・凋亡ResearchonapoptosisofcoloncancercelllineHT29inducedbyNDGA【ABSTRACT】Objective:TofindouttheeffectofNDGA(NordihydroguaiareticAcid),thelipoxygenaseinhibitor,oncoloncancercelllineHT29invi

3、trofromtheaspectsofcellgroicroscopetoobservemorphologicchangeofcellsasicroscopetoobservechangesofcell’sultramicrostructureandapoptoticbody.③floetrytoexaminetheapoptosisandperiodicchangesofcells.Results:LEZK380），酶联免疫检测仪（BIORAD450型），流式细胞仪（FACScan型，美国BD公司），JS

4、MT300扫描电镜（日本JEOL公司）以及其他培养细胞常用设备。1.2材料和试剂1.2.1结肠癌细胞株HT29细胞株购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。1.2.2主要试剂RPMI1640培养液和胰蛋白酶购自Gibco公司。新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。NDGA购自Calbiochem公司，四氮唑盐（MTT）购自Sigma公司，碘化丙啶（PI）购自北京岳泰生物制品公司。1.3细胞培养常规培养HT29结肠癌细胞。采用处于指数生长期的细胞进行实验，分别加入不同浓度的药物处理后，继续在CO2恒

5、温箱孵育相应的时间后，进行有关指标检测。1.4细胞形态学观察1.4.1倒置显微镜观察细胞传代后，每隔6h分别应用高倍镜及低倍镜观察一次HT29结肠癌细胞的形态学变化，细胞生长情况，培养液的情况。贴壁后，每隔4h观察1次。药物处理后每隔2h观察1次细胞生长情况，形态学变化。1.4.2扫描电镜观察应用NDGA（终浓度100μmol/L）处理48h。取出对照组及加药组长有癌细胞的载玻片，经3％戊二醛前固定，再应用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗3次，1％四氧化锇（锇酸）固定1h，再用0.1mol/L磷酸盐

6、缓冲液（PBS）清洗3次，乙醇梯度脱水，醋酸异戊脂置换，CO2临界点干燥、粘托、镀金，JSMT300扫描电镜15KV加速电压观察，拍照。1.5癌细胞凋亡检测1.5.1MTT法绘制生长曲线实验设计为5组：空白组（不加细胞）、对照组（加入PBS液）、NDGA组（分别为1，10，100μmol/L），每组设5个平行孔。将培养瓶中贴壁的结肠癌HT29细胞应用0.25％的胰酶消化，细胞形态发生改变时，加入含有小牛血清培养液中和，吹打，制成细胞悬液，以104／ml的浓度接种于96孔培养板，每孔接种200μl。培养24h

7、后，分别加入不同浓度药物，分别继续培养24，48，72h后取出一块培养板检测细胞光密度（OD）。实验方法：每孔加入新鲜配制的MTT液（5mg/ml）20μl，37℃，继续培养4h，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入DMS0150μL，放置振荡器10min，使结晶物充分溶解，然后在酶联免疫检测仪上应用双波长(490,570nm)测光密度值，以空白组OD值调零。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制生长曲线。1.5.2流式细胞仪检测癌细胞凋亡率及细胞周期变化分别收集对照组及NDGA药物（100μmol/L）作用48h的H

8、T29结肠癌细胞。先用0.25％的胰酶消化，再用含小牛血清培养液中和，然后再加入离心管中离心，用PBS液漂洗后再离心5min（1000r/min），加入70％的冷乙醇固定，4℃冰箱保存过夜。以PBS液漂洗后以100目筛网过滤，再离心5min（1500r/min）。加入PI工作液0.05ml，室温避光30min，上机检测。上机前以标准荧光微球体调整仪器的变异系数并稳定在2％以内。上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数