蒲公英总dna的提取及其rapd

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1、蒲公英总DNA的提取及其RAPD作者：李喜凤，杜云锋，张红梅，郝哲，许闽，白雁【摘要】目的建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选。结果建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系。25μl反应体系中含有：1×TaqMixbuffer，50ngDNA模板，0.4μmol/L引物，1.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTPs，1.25UTa

2、q酶。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，38℃复性1min，72℃延伸2min，共40个循环；72℃延伸10min，反应结束后，4℃保存。结论这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。【关键词】蒲公英；基因组DNA提取；随机扩增多态性DNA技术　蒲公英为菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.，碱地蒲公英TaraxacumsinicumKitag.或同属数种植物的干燥全草，具有清热解毒、消肿散结、利

3、尿通淋之功效，主要用于乳痈、肺痈、肠痈、痄腮、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛等症［1］。蒲公英品种繁多，资源丰富且来源复杂，目前对其鉴别一直沿用经典的性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。而这些方法的鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，在生物学上为物种的遗传表现型，受到遗传因素、生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等影响，具有很大的变异性，存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。　　随机扩增多态性DNA（randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）技术是由美

4、国杜邦公司的科学家arker：大连TaKaRa公司；2×TaqPCRMasterMix：北京TIANGEN公司；10mer随机引物：上海英骏生物技术有限公司合成；其余化学试剂均为国产分析纯。　　1.3仪器　　DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；GelDoc2000TM型凝胶图像分析仪：美国BIO-RAD公司；梯度PCR仪：德国Biometra公司；GR22G型高速低温离心机：日本日立公司；微量移液器：德国eppendorf公司。　　2方法　　2.1蒲公英叶基因组总DNA的提取和检测在经典的CTAB法

5、的基础上加以改良：称取0.5g样品加入10%的PVP一起在冰上用玻璃砂在研钵中研磨，磨碎后转移至10ml离心管中，加入10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液(250mmol/L氯化钠，250mmol/LTris-HClpH=8.0,50mmol/LEDTApH=8.0，5%PVP)，冰浴10min，10000r/min离心5min，弃上清液，再用洗涤缓冲液洗涤沉淀1次。加入1ml2×CTAB提取缓冲液(100mmol/lTris-HClpH=8.0，20mmol/LEDTApH=8.0，1.4mol/L氯化钠，

6、2%CTAB，5%PVP)，100μlβ-巯基乙醇，65℃温育3h，不时振摇。4℃12000r/min离心10min，取上清液于另一离心管中，加入适量的RNaseA酶，37℃温育45min，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提3次，4℃12000r/min离心10min。取上清液分装于1.5mlEP中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，于-20℃静置30min或过夜，4℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，4℃12000r/min离心5min，在室温下干燥。将干燥

7、的DNA沉淀溶解于100μlTE缓冲液(10mmol/LTris-HClpH=8.0，1mmol/LEDTApH=8.0)中，4℃保存。经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，GelDoc2000TM型凝胶图像分析系统拍照，于蛋白核酸测定仪上测定其原始浓度，最后统一稀释成终浓度20ng/μl，保存-20℃备用。　　2.2RAPD-PCR初始扩增体系参照常规的PCR反应中各组分的量及相关研究论文，确定蒲公英RAPD-PCR初始的反应体系为：反应总体积25μl，内含1.2×TaqMixbuffer(镁离子1.8mmo

8、l/L、Taq酶1.5U、dNTPs0.3mmol/L)、模板DNA50ng、随机引物0.2mmol/L。根据预试验的结果，以S36(AGCCA-GCGAA)为引物，对蒲公英RAPD反应体系中的5种主要反应成分分别进行单因素试验，每一个合适条件确定后作为后续研究的一个条件。　　扩增程序定为94℃预变性5min；然后进行40个循环：94℃变性1min，37℃复性1min，72℃延伸1.5min；循环后72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增