单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达

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1、单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达王福旭　赵冰　程云会　潘崚　罗建民　张学军　董作仁【摘要】　　本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的IgVH和IgVL基因，重组PCR法用一段编码(Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方

2、法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的IgVH和IgVL基因，并成功制备了scFv片段和scFv-MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo/scFv-MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示，融合蛋白分子量约65kD,与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30%。结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞

3、淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo/scFv-MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。【关键词】本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的IgVH和IgVL基因，重组PCR法用一段编码(Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序

4、列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGL　　ConstructionandExpressionofAProkaryoticExpressionPlasmidofIdiotypicVaccineagainstBCellLymphoma：EncodingtheFusionGenesofSingle-ChainVariableFragmentandMCP-3　　　DepartmentofHematology,TheSecondHospital;1Departmentofmolecularbiology,Hebei

5、MedicalUniversity,Shijiazhuang050000,ChinaAbstractTheaimidencodingthefusiongeneofsingle-chainvariablefragmentandmonocytechemotacticprotein-3(MCP-3).ThecDNAsofimmunoglobulin(Ig)VHandIgVLplifiedbyRT-PCRandassembledintothesingle-chainvariablefragment（scFv）byrebinantPCRmethod.ThecDNAsofIgV

6、HandIgVLentsofscFvandMCP-3ethodagain.TheresultsindicatedthatthefusiongeneofscFv-MCP-3idsuccessfullyidentifiedbysequencingandrestrictionendonucleasesexamination.Finally,thefusionproteinid,encodingthefusiongeneofsingle-chainvariablefragmentphoma,phoma;scFv;monocytechemotacticprotein-3　　B

7、细胞淋巴瘤细胞表面的独特型膜免疫球蛋白(smIg)是一种明确的肿瘤相关性抗原（tumorassociatedantigen,TAA）〔1〕，结合免疫佐剂主动免疫后能诱导抗淋巴瘤肿瘤免疫应答〔2〕。研究表明，单链可变区片段（scFv）可以模拟完整的免疫球蛋白的抗原性,具有相对分子量小、组织穿透力强、血浆清除快、易于基因改造并可通过细菌发酵大量生产等优点〔3〕，有很大的临床应用潜力。本研究中我们以BABL/c小鼠源的B细胞淋巴瘤细胞株A20作为模型,单核细胞趋化蛋白MCP-3(monocytechemotac-ticprotein-3)为免疫佐剂，运用抗体工程和基因