单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达论文

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1、单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达论文王福旭赵冰程云会潘崚罗建民张学军董作仁【摘要】本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的IgVH和IgVL基因，重组PCR法用一段编码(Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选

2、用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列.freelidofIdiotypicVaccineagainstBCellLymphoma：EncodingtheFusionGenesofSingle-ChainVariableFragmentandMCP-3DepartmentofHematology,TheSecondHospital;1Departmentofmolecularbiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,ChinaAbstractTheaimidencodingthefusiongene

3、ofsingle-chainvariablefragmentandmonocytechemotacticprotein-3(MCP-3).ThecDNAsofimmunoglobulin(Ig)VHandIgVLplifiedbyRT-PCRandassembledintothesingle-chainvariablefragment（scFv）byrebinantPCRmethod.ThecDNAsofIgVHandIgVLentsofscFvandMCP-3ethodagain.Theresultsindicatedthatthefusiongeneofs

4、cFv-MCP-3idsuccessfullyidentifiedbysequencingandrestrictionendonucleasesexamination.Finally,thefusionproteinid,encodingthefusiongeneofsingle-chainvariablefragmentphoma,phoma;scFv;monocytechemotacticprotein-3B细胞淋巴瘤细胞表面的独特型膜免疫球蛋白(smIg)是一种明确的肿瘤相关性抗原（tumorassociatedantigen,TAA）［1］，结合免疫佐

5、剂主动免疫后能诱导抗淋巴瘤肿瘤免疫应答［2］。研究表明，单链可变区片段（scFv）可以模拟完整的免疫球蛋白的抗原性,.freelonocytechemotac-ticprotein-3)为免疫佐剂，运用抗体工程和基因工程技术，制备A20细胞的独特型smIg的scFv片段，并与同种鼠源的MCP-3基因连接，构建原核表达载体pGLo/scFv-MCP-3，并在大肠杆菌中实现高产量表达融合蛋白，为进一步纯化及作为融合蛋白疫苗进行主动免疫治疗的实验研究提供了基础。材料和方法细胞、质粒和菌种源于BALB/c小鼠的B细胞淋巴瘤细胞株A20购自美国ATCC。含有BALB/c

6、小鼠源的MCP-3基因序列的质粒为中南大学湘雅医学院肿瘤研究所胡锦跃教授惠赠。原核表达质粒pGLo及大肠杆菌DH5α株为本室保留。酶和主要试剂高糖DMEM购自美国Gibco公司。FBS为杭州四季青产品。TRIZOLRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司。Pfu酶、Taq酶、DNAMarker、胶回收纯化试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自上海生工公司。其它RT-PCR相关试剂及克隆载体pGEM-Teasy为Promega产品。限制性内切酶SacⅠ，KpnⅠ、T4连接酶购自TaKaRa公司。引物设计根据文献［4］报道的A20细胞IgVHcDNA序列leade

7、r区与FR4区，自行设计引物VH05'、VH03'，并通过引物设计软件Primer5验证引物的有效性。IgVLcDNA扩增引物VL05'、VL03'根据小鼠κ链FR1区和恒定区设计，经相同方法验证有效性。构建的重组质粒如图1所示，载体pGLo携带有GFP（绿色荧光蛋白）基因，重组的scFv-MCP-3融合基因片段插入到GFP编码区的下游，并保持与前者一致的开放性读码框。IgVH、IgVL基因片段由编码（Gly4Ser）3的基因序列连接，IgVL与MCP-3基因片段以编码氨基酸序列为NDAQAPKS的核苷酸序列间隔。GFP和scFv-MCP-3之间设计Ⅹa因子蛋

8、白酶识别位点，编码的核苷酸序列为ATC