rantes、mip-1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制研究

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1、RANTES、MIP?1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制研究王晓颖樊嘉周俭邱双健吴晓峰刘银坤汤钊猷【摘要】目的探讨RANTES、MIP?1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制。方法使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察RANTES、MIP?1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(F?actin)聚合的变化。采用明胶酶谱法分析RANTES、MIP?1α对人肝癌细胞基质金属蛋白酶分泌及活性的影响。结果RANTES、MIP?1α可诱导人肝癌细胞内F?actin的聚合，并刺激细胞突起和伪足形成。明胶酶谱显示RAN

2、TES、MIP?1α刺激后人肝癌细胞基质金属蛋白酶MMP?2、MMP?9等活性显著增加，降解基质能力增强。结论RANTES、MIP?1α趋化因子可以诱导F?actin聚合促进人肝癌细胞定向运动，并通过增加基质金属蛋白酶活性提高人肝癌细胞侵袭能力。【关键词】肝肿瘤；趋化因子；细胞运动；肿瘤浸润MechanismofRANTESandMIP?1αpromotinginvasionandmigrationofhepatomacarcinomacells【Abstract】ObjectiveToinvestig

3、atemechanismofchemokinesincludingRANTESandMIP?1αpromotinginvasionandmigrationofhepatomacarcinomacells(HCC).MethodsThepolymerizationofHCCF?actinstimulatedbyRANTESandMIP?1αetryandconfocalmicroscope.GelatinzymographyassayatrixmetalloproteinaseofHCC.ResultsB

4、othRANTESandMIP?1αcouldprominentlypromotepolymerizationofF?actinandformationofcellprocessandpseudopodiaofHCC.GelatinzymographyassaysshoulationotemigrationofHCCbyinducingpolymerizationofF?actinandincreaseinvasivepotentialofHCCbyenhancingactivityofMMPs.【Ke

5、yacarcinoma;Chemokines;Cellmigration;Tumorinvasion趋化因子(chemokines)是一类分泌型小分子蛋白质。近来发现其与肿瘤侵袭转移密切相关［1-2］。我们前期研究发现肝癌细胞表达CCR1趋化因子受体，其配体RANTES、MIP?1α等趋化因子可以促进肝癌细胞侵袭运动［3］。为进一步阐明RANTES、MIP?1α等趋化因子促进肝癌细胞侵袭运动的机制，本研究深入观察RANTES、MIP?1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(F?actin)及基质金属蛋白酶变

6、化情况。1材料与方法1.1细胞培养高转移人肝癌细胞株MHCC97H由本所建立。采用DMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。1.2悬浮细胞肌动蛋白聚合试验将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁，重悬于PBS，浓度为1×106个细胞/ml。取上述细胞悬液分别加入含100ng/ml的RANTES或MIP?1α(RD公司)无血清DMEM培养液，不加趋化因子为空白对照。分别于趋化因子刺激后15、30、60、120、300和600s时，加入固定染色液［含0.1mg/mlLPC，磷酸缓

7、冲液配制的10%福尔马林，1.65×10-6mol/L的FITC?Phalloidin(MolecularProbes公司)］并染色10min。染色后的细胞1500r/min离心5min，用1mlPBS液重悬细胞，上流式细胞仪分析。每次分析1×105个细胞。最大激发波长为560nm，吸收波长为540nm。以空白对照组的荧光总量为100%计算趋化因子刺激各时间点荧光总量的相对比值。1.3贴壁细胞的肌动蛋白聚合试验将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液

8、重悬细胞，制备浓度为1×104个细胞/ml。将上述细胞悬液加入预置细胞培养载玻片的6孔培养板的各室中，培养24h至肿瘤细胞完全贴壁，PBS液洗涤。每室加入含100ng/mlRANTES或MIP?1α的无血清高糖DMEM培养液2ml，不加趋化因子为对照，孵育2h。吸弃培养液，用PBS液洗涤。加入3.7%中性甲醛固定10min，PBS液洗涤。丙酮脱水1min。每孔加入1mlPBS液配制的0.2%TritonX?100，室温处理10min透化细胞