资源描述：
《marfan综合征fbn1基因新的剪接位点的置换突变论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变论文.freele,MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织病,发病率为1/(5000~10000),25%~30%患者为散发病例。MFS主要累及心血管、骨骼和眼等系统或器官,.freelRNA包含9749个核苷酸。自1991年Dietz等提出FBN1突变是MFS的致病原因以来,发现的FBN1突变有601种,分布于整个FBN1。原纤维蛋白1为相对分子质量320kD的糖蛋白,由2871个氨基酸组成,是构成细胞外微纤维(直径10~12nm)的主要蛋白之一。因此FBN1突变将影响微纤维的结构与功能12。近几年发现另1种
2、与MFS有关的基因――转化生长因子β受体2(transforminggroanceliquidchromatography,DHPLC)异源双链分析与DNA测序等方法,对1例MFS患者进行FBN1突变筛查与鉴定,探讨新的FBN1突变。1对象与方法1.1对象先证者,女,12岁,以“突发心悸、胸闷半天”于2003年11月入福建省立医院心外科。患者身高170cm,肢展173cm,体质量37kg,有蜘蛛样指征。心脏二维彩超示主动脉窦部增宽,主动脉瓣呈二叶启闭及返流（＋）,二尖瓣脱垂;有晶状体异位和高度近视，临床诊断为MFS。该患者有家族史,其母有身材瘦高,双眼白内障和晶状
3、体异位等MFS临床表现。其父临床表型正常。50名无关正常人为对照组。1.2方法1.2.1基因组DNA抽提取患者静脉血2mL,EDTA抗凝,用全血DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)抽提基因组DNA。1.2.2聚合酶链反应(PCR)对FBN1的65个外显子进行PCR扩增。引物由美国JohnsHopkins大学医学院Dietz教授惠赠。引物分别位于外显子两侧的内含子区域。其中第29外显子正向:5’CAGACATCCAAACCATATCAG3’反向:5’GAACCTACTGAGAGATTCAAC3’PCR反应体系50μL,含0.2mmol/LdNTP,1.5mmol
4、/LMg2+,DNA模板200ng,ExTaqDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)1.25U,0.4μmol/L引物。用基因扩增仪(Hema240,珠海黑马医学仪器公司)进行PCR反应。反应条件:95℃5min,95℃30s→55~61℃30s→72℃50s,共30个循环;72℃最后延伸10min34。PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3DHPLC筛选FBN1突变用DHPLC系统(美国Transgenomic公司)对PCR反应产物进行筛选突变分析5。1.2.4DNA测序用全自动测序仪(ABI377型,美国AppliedBi
5、osystems公司)对DHPLC图形异常的PCR产物进行DNA序列测定。1.2.5限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RELP)用RFLP进一步鉴定FBN1的Intron29+4AT。第29内含子PCR扩增引物参照文献6设计,正向:5’GACTCAAGCCTGCTTGACTCC3’反向:5’GCCCTGCCTCTTAAATAGTG3’扩增片段326bp。限制性内切酶为OliI,切点:5’CANNNGTG3’;3’GTGNNNNCAC5’,酶切反应时间16h。第29内含子野生型的PCR产物不能发生酶
6、切反应。如果存在Intron29+4AT,能够发生酶切反应,并形成93bp和233bp两个片段(图1)。黑体部分为引物,下划线处为突变点,斜体为外显子部分。:切点.图1FBN1第29内含子野生型扩增片段序列（略）Fig1Sequenceofamplificationfragmentforintron29ofFBN12结果2.1DHPLC图形分析对照组及患者父亲的FBN1第29外显子PCR扩增产物在DHPLC上显示单峰,但患者及其母呈现低矮、宽大的双峰图形(图2)。P:先证者;M:先证者母亲;F:先证者父亲;N:正常人.图2FBN1第29外显子DHPLC图（略）Fi
7、g2DHPLCchromatogramforexon29ofFBN12.2DNA测序FBN1第29外显子PCR扩增产物为预期的214bp。测序显示患者与其母的FBN1有Intron29+4AT。其父第29外显子显示正常序列(图3)。重复扩增并进行DNA测序,结果相同。2.3RFLPFBN1第29内含子PCR产物用OliI限制性内切酶切后电泳显示,患者与其母为两条带,片断长度为326bp与233bp,对照组和患者父亲为单一条带,长度为326bp(图4)。↓:Intron29+4位置.P:先证者;M:先证者母亲;F:先证者父亲.图3FBN1第29外显子测序结果（略）F
8、ig3DN
