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1、Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变：伍严安,陈喜军,黄肖利,陈同,陈发文,陈发林,黄毅【关键词】马凡综合征;,原纤维蛋白 摘要:目的对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变。方法应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质。用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变。结果发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29+4A>T)。结论FBN
2、1的Intron29+4A>T可能为该MFS患者的发病原因。 关键词:马凡综合征;原纤维蛋白1;基因;突变;色谱法，高效液相；多态性，限制性片段长度 马凡综合征(Marfansyndrome,MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织病,发病率为1/(5000~10000),25%~30%患者为散发病例。MFS主要累及心血管、骨骼和眼等系统或器官,临床表现有夹层主动脉瘤、二尖瓣脱垂、蜘蛛脚样指趾、晶状体异位等。MFS还可累及肺、皮肤和中枢神经系统等器官或系统,临床表现有自发性气胸、皮肤不能解释的牵拉体征和腰骶部硬脊膜的扩张等。原纤维蛋白1(fibrillin1)基因(FBN1)
3、全长约235kb,由65个外显子构成,定位于15q21.1。其mRNA包含9749个核苷酸。自1991年Dietz等提出FBN1突变是MFS的致病原因以来,发现的FBN1突变有601种,分布于整个FBN1。原纤维蛋白1为相对分子质量320kD的糖蛋白,由2871个氨基酸组成,是构成细胞外微纤维(直径10~12nm)的主要蛋白之一。因此FBN1突变将影响微纤维的结构与功能[12]。近几年发现另1种与MFS有关的基因――转化生长因子β受体2(transforminggroanceliquidchromatography,DHPLC)异源双链分析与DNA测序等方法,对1例MFS患者进行FBN
4、1突变筛查与鉴定,探讨新的FBN1突变。 1对象与方法 1.1对象先证者,女,12岁,以“突发心悸、胸闷半天”于2003年11月入福建省立医院心外科。患者身高170cm,肢展173cm,体质量37kg,有蜘蛛样指征。心脏二维彩超示主动脉窦部增宽,主动脉瓣呈二叶启闭及返流（＋）,二尖瓣脱垂;有晶状体异位和高度近视，临床诊断为MFS。该患者有家族史,其母有身材瘦高,双眼白内障和晶状体异位等MFS临床表现。其父临床表型正常。50名无关正常人为对照组。 1.2方法 1.2.1基因组DNA抽提取患者静脉血2mL,EDTA抗凝,用全血DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)抽提基因组DNA
5、。 1.2.2聚合酶链反应(PCR)对FBN1的65个外显子进行PCR扩增。引物由美国JohnsHopkins大学医学院Dietz教授惠赠。引物分别位于外显子两侧的内含子区域。其中第29外显子 正向:5’CAGACATCCAAACCATATCAG3’ 反向:5’GAACCTACTGAGAGATTCAAC3’ PCR反应体系50μL,含0.2mmol/LdNTP,1.5mmol/LMg2+,DNA模板200ng,ExTaqDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)1.25U,0.4μmol/L引物。用基因扩增仪(Hema240,珠海黑马医学仪器公司)进行PCR反应。反应条件:95℃5m
6、in,95℃30s→55~61℃30s→72℃50s,共30个循环;72℃最后延伸10min[34]。PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.3DHPLC筛选FBN1突变用DHPLC系统(美国Transgenomic公司)对PCR反应产物进行筛选突变分析[5]。 1.2.4DNA测序用全自动测序仪(ABI377型,美国AppliedBiosystems公司)对DHPLC图形异常的PCR产物进行DNA序列测定。 1.2.5限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RELP)用RFLP进
7、一步鉴定FBN1的Intron29+4A>T。第29内含子PCR扩增引物参照文献[6]设计, 正向:5’GACTCAAGCCTGCTTGACTCC3’ 反向:5’GCCCTGCCTCTTAAATAGTG3’ 扩增片段326bp。限制性内切酶为OliI,切点:5’CANNNGTG3’;3’GTGNNNNCAC5’,酶切反应时间16h。第29内含子野生型的PCR产物不能发生酶切反应。如果存在Intron29+4A>T,能够发生酶切
