血红蛋白a2单克隆抗体的制备与鉴定

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1、血红蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定作者：陈志成，杨金菊，刘蓉，曲海霞，王婉，刘莉，柳晓兰，陈勇刘莹，高建恩，孙启鸿【摘要】本研究目的是制备鼠抗人血红蛋白A2（HBA2）单克隆抗体（McAb）并进行初步鉴定。将正常人胎肝组织匀浆离心并分离出人胎肝核总蛋白,用人胎肝核总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并通过间接ELISA法、onoclonalAntibodyagainstHomoSapiensHemoglobinalpha2(HBA2)AbstractThisstudyonoclonalantibodies(McAbs)a

2、gainstHomosapienshemoglobinalpha2(HBA2).Normalhumanfetallivertissuesogenized,andhumanlivernuclearprotEinsanfetallivernuclearprotEInsmunizeBALB/cmiceforpreparingMcAbsbyhybridomatechnique.TheMcAbsspecificitymunohistochemistry.Theantigenacellline,AEE091,secretingspecificMcAbag

3、ainstHBA2immunohistochemistryassayshoanlivernuclearprotein.UsingAEE091McAb,isolationoftheproteinantigenbyIPrevealedthatAEE091McAbcouldrecognize15kDprotein.ScreeningtheUniZAPXRpremadelivercDNAlibraryacellsupernatantsdemonstratedthatAEE091McAbspeciallyreactedacelllinestably

4、secretingspecificMcAbagainstHBA2isestablished.ThespecificMcAbagainstHBA2ia.Keyosapienshemoglobinalpha2;McAb;cDNAexpressionlibrary;thalassanemiaJExpHematol2007;15(4):823-826血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。人体内的血红蛋白由4个亚基构成，分别为2个α亚基和2个β亚基，血红蛋白的每个亚基由1条肽链和1个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子

5、包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血)是由于珠蛋白基因组织的多种突变或缺失，致使珠蛋白合成障碍，正常血红蛋白不能形成，使红细胞易被破坏，寿命缩短。珠蛋白生成障碍性贫血是一种对人类健康危害较大的遗传性疾病，在我国南方较为常见。正常成人红细胞所含主要血红蛋白A(α2β2)由2条α珠蛋白链和2条β珠蛋白链组成，其余2%-3％是血红蛋白A2(α2δ2)，2％以下是血红蛋白F(α2γ2)。珠蛋白生成障碍性贫血的基因突变是异质、多态性的，加之纯合子、杂合子的差异，因而有非常不同的表现型。基因完全缺失或基因

6、突变使1种或2种珠蛋白完全不能合成者，称为α、β或(αβ)珠蛋白生成障碍性贫血；尚能部分合成者，称为α+、β+或(αβ)+珠蛋白生成障碍性贫血［1，2］。重型β珠蛋白生成障碍性贫血的HbA2通常减低，也有正常或升高的。轻型β珠蛋白生成障碍性贫血（A2型）的HbA2都轻度增高，HbA2的轻度增高是轻型β珠蛋白生成障碍性贫血的唯一阳性发现。传统的HBA2定量需经过HB电泳，计算，需要较长的时间且步骤繁琐［3，4］。因此，制备的HBA2单克隆抗体，可能为珠蛋白生成障碍性贫血的诊断提供一个快速，经济和准确的方法。材料免疫和筛选用胎肝核总蛋白，由本室

7、制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。胎肝核总蛋白抗原的制备胎肝组织以每分钟700-750转制成匀浆，10克胎肝组织加40ml匀浆缓冲液，以70900×g蔗糖密度梯度离心90分钟，离心后取沉淀物，获得胎肝核总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。鼠抗人单克隆

8、抗体的制备将胎肝核总蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给小鼠多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，ELISA法测定