胞浆型磷脂酶a2在急性心肌梗死大鼠心肌组织中的表达论文

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1、胞浆型磷脂酶A2在急性心肌梗死大鼠心肌组织中的表达论文李卫华韩俊愈孙常青谢强赵岩林粼【摘要】目的观察急性心肌梗死早期心肌组织胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA及蛋白表达,探讨cPLA2在心肌细胞损伤中的作用。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组，心肌梗死组(AMI组，按时间不同分5组，每组10只)，建立大鼠急性心肌梗死模型，按照心肌梗死不同时间(0、1、2、3、6和12h)处死动物。免疫组化检测心肌cPLA2蛋白表达情况。采用RTPCR检测心肌cPLA2mRNA表达水平。通过透射电镜观察心肌细胞超微结构的改变。结果①与假手术组比较，AMI组心肌cP

2、LA2mRNA水平均出现不同程度上调，以梗死后2h达到峰值(0.655±0.035.freelg/kg)行腹腔注射麻醉,经口气管插管，接小型呼吸机，沿胸骨左缘切开第4肋间,剪开心包，暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥交点下0.1cm结扎左冠脉前降支，以肉眼见心肌组织变白,局部心肌运动减弱,心电图出现ST段明显上抬,提示结扎成功。AMI后1、2、3、6、12h处死动物迅速取出心脏,留取部分左心室心肌(前壁近心尖部)，进行相关指标检测。假手术组模型制备方法同上，但只穿线不结扎冠状动脉。1.2主要试剂与仪器TrizolA+总RNA提取剂、TIANScri

3、ptcDNA第一链合成试剂盒、TagPlusDNAPolymerase等均购自厦门海诺达科学仪器公司。CF15高速冷冻离心机、H600透射电镜(Hitachi，日本)，PT2000聚合酶链反应(PCR)扩增仪(MJPE，美国)，LeicaRM2025病理切片机(德国);OlympusBX40显微镜(日本);MoticMed6.0数码医学图像分析系统(北京麦克奥迪仪器仪表有限公司，中国);UV200紫外分光光度计(Shimadiu,.freelRNA表达①心肌组织总RNA提取及浓度和纯度测定：参照提取剂说明书进行操作。取新鲜100mg心肌组织加1

4、mlTrizol,玻璃匀浆器中匀浆,室温放置5min，4℃离心10min收集上清。加0.2ml氯仿,剧烈摇晃15s,室温放置3min,4℃离心15min,转移上层无色液相(约0.5ml)至另一聚乙烯离心管。加0.5ml异丙醇,盖上盖子,倒转数次彻底混匀，室温孵育25min,4℃离心10min,弃上清。加1ml质量分数为75%的乙醇,洗涤沉淀，样品4℃离心3min,弃上清,剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，空气中挥发管内残余乙醇至干，加入0.05ml左右DEPC水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。测定样本在波长为260、280和320nm下的吸光度

5、值(A260、A280和A320),计算RNA浓度及纯度(各样本A260/A280比值均1.65)。②互补DNA(cDNA)合成：逆转录采用RTPCR试剂盒，根据说明书使用20μl的混合体系(其中1μl包含1μg总RNA)，42℃50min，95℃5min，-20℃冰冻保存。③PCR扩增：目标基因cPLA2及内参照βactin反应体系,总体积均为20μl,DEPC水7.5μl、10×buffer2μl、dNTP4μl、Tag酶0.5μl、cDNA2μl、cPLA2(或βactin)上、下游引物各1μl,各管中加入上述反应体系,PCR扩增仪扩增。

6、扩增条件:94℃变性5min，94℃变性40s,48℃复性40s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸10min。cPLA2、βactin引物序列:cPLA2:上游5′CGACGCAGCGGTAGCAGAT3′,下游3′TGGACGGCATAGGGAACT5′，扩增产物119bp;βactin：上游5′TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3′，下游5′AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA3′，扩增产物432bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。④电泳及条带分析:制备凝胶，扩增产物在含溴化乙锭(EB)及质量分数为1.5%的琼脂

7、糖凝胶中电泳(80V),电泳缓冲液为质量分数为0.5%的Tris乙酸,将扩增产物及参照标准(Marker)各10μl与5μl上样buffer混匀、点样,80mV电泳至条带跑至凝胶2/3处。紫外光下观察，凝胶图像分析系统扫描扩增产物电泳条带的密度,计算cPLA2的相对量以及cPLA2电泳条带密度/βactin电泳条带密度。1.4免疫组化检测心肌组织cPLA2蛋白表达标本经4%多聚甲醛液固定、脱水、石蜡包埋，切成厚4μm切片。切片经常规脱蜡和水化，高压抗原修复5min，用PBS漂洗3次，每次5min。一抗为兔抗大鼠cPLA2多克隆抗体(Abcam公司

8、，英国)，二抗为快速型酶标记羊抗兔IgG(福州迈新生物技术开发公司)。滴加以1∶200的比例稀释一抗，37℃