胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤研究进展

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1、胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤研究进展　　摘要:　胞嘧啶脱氨酶基因导入肿瘤细胞可将无毒性的原药在肿瘤细胞内代谢为具细胞毒的产物而发挥抗肿瘤效应。本文综述了该基因的克隆、作用机制和在消化道肿瘤治疗中的研究进展。　　随着分子生物学的迅猛发展，基因治疗这一崭新方法尽管还多处于实验研究手段，却已显示出良好的应用前景[1]。自1991年Huber等[2]提出病毒导向的酶解原药疗法（virusdirectedenzymeprodrugtherapy,VDEPT）以来，有关的基因研究成为热门课题。目前，一个新的基因治疗系统——EC-CD/5-FC（大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶）系统正日益受到高

2、度关注[3]。本文就胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因治疗消化道肿瘤的现状作一综述。　　CD基因的克隆　　胞嘧啶脱氨酶是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，哺乳动物细胞中不含该酶。Austin等[4]于1992年首先从大肠杆菌株中采用传统方法提取质粒DNA，进一步分离、纯化并转染宿主菌，初步构建成原核细胞中表达的CD质粒载体，克隆了编码CD的大肠杆菌基因，利用阳性基因筛选方法，获得一携带10.8kb的DNA插入质粒，其中一3kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白质分子量为52000,DNA序列分析显示一含427个氨基酸开放读码框架编码CD。　　为证实CD基因在真核

3、细胞中表达以发挥作用，研究者采用寡核苷酸突变（oligonucleotidesite-directedmutagenesis）技术，将CD基因起始密码子由GTG→ATG，从而产生一5’起始密码子，选择pRc/CMV真核表达载体，构建成真核表达质粒pCMV/CD-1。以脂质体法将pCMV/CD-1导入人结肠癌oloney小鼠白血病病毒构建而成，为RNA病毒，基因组编码在一条单链RNA分子上，进入细胞后，逆转录成双链DNA，此DNA进入细胞核整合在受体细胞DNA上，并以此为模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV转导CD基因，将CD基因整合于病毒长末端重复（LTR）的最末端，因而整合后的病毒

4、基因结构可受到保护不致受损[6-8]。　　目前转导CD基因多选择腺病毒(adenovirus,Ad)载体[9，10]。由于腺病毒为一双链DNA病毒，宿主范围广泛，尤其能有效地感染非分裂状态的细胞，另外，它不能整合到宿主细胞染色体上，因而较逆转录病毒更为安全。重组腺病毒载体主要来自于2型和5型腺病毒，容量大，可装载达7.6kb。已有学者选用Ad载体介导CD基因转染入结肠癌HT29细胞系，将携带有大肠杆菌标记基因（Lacz）的腺病毒注射到肿瘤组织中底物X-gal染色来判断基因转染效率。结果显示外源基因经单次注入后近5%-30%的肿瘤组织表达Lacz基因[11]。　　作用机制　　由于哺乳动物

5、细胞中不存在CD，因而不能将胞嘧啶转化成尿嘧啶，更不能将5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine,5-FC）转化成5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）。但通过基因转移技术将CD基因转入哺乳动物细胞，则哺乳动物细胞可将一些原来无毒性的原药（5-FC）转化为有细胞毒性的代谢产物（5-FU），导致细胞自杀性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的浓度下对哺乳动物无毒性作用，经CD脱氨为5-FU，后者则具有高度细胞毒性，为临床广泛使用的抗肿瘤化疗药物[5，8，11]。　　CD基因作用的一个十分突出特点即所谓的“旁观者效应”（bystandereffect），这与某些自杀基因的

6、作用机制相似[12]。Hirschoosome）”存在，因其起着封闭细胞间转运的作用，推测旁观者效应并非上述机制，尚有其它机制参与，如细胞凋亡、原药代谢产物本身可穿过细胞膜等可能机制[14，15]。　　几种消化道肿瘤CD基因治疗现状　　结肠癌　CD基因治疗的研究对象以结肠癌为多。Huber等[16]观察到裸鼠5-FC的半衰肠期大约是40分钟，腹腔内给予500mg/(kg·d)的5-FC，其血浆水平可维持在4000μmol。体外试验显示：对于CD+结肠癌细胞，5-FC的IC50仅为5μmol；而体内试验结果表明无论是腹腔内还是静脉内给予5-FC，都同样观察到明显的抗肿瘤效应。　　Rich

7、ard等[9]将组织特异性因子癌胚抗原（CEA）转录调控序列的三个部分分别插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，构建了一系列pCEA/CD基因载体，通过分析荧光素活性，筛选出活性最高的pCEA/CD-145基因。体外实验将其转导入大肠癌NCIH508细胞中，在5-FC存在下，基因表达发挥出良好的原药转换抗肿瘤效应，CD+的NCIH508细胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH508细胞其IC50达516μmol。体内实验比较转导前后的大