dxs6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究

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1、DXS6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究【摘要】　　目的用分子克隆技术制备DXS6804基因座等位基因分型标准物，并用于中国云南普米族人群的群体遗传学研究，解决长期困扰短串联重复序列分型上存在的准确性和标准化问题。方法用PCR扩增出DXS6804基因座的各等位基因片段，PCR产物克隆后，DNA测序证实插入片段的大小和结构，按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后，制备出该基因座的等位基因分型标准物，进行群体研究。结果调查了中国云南地区普米族人群基因座的基因型分布频率，发现DXS680

2、4基因座两个分型标准物外等位基因。结论分子克隆技术是制备等位基因分型标准物的可靠方法，DXS6804基因座是一个适合我国法医学和群体遗传学分析的遗传标记。【关键词】等位基因分型标准物；短串联重复序列；遗传多态性　　StudyontheconstructionofstandardDXS6804allelicladderviamolecularcloninganditsgeicpolymorphism　inChineseyunnanpumipopulations　　ABSTRACT:ObjectiveToresolvet

3、heproblemoftheaccuracyandstandardizationofSTRPCRtypinginforensicpractice,constructDXS6804allelicladderbymolecularclonningandapplytheminapopulationstudyonthePumipopulationinYunnan,China.MethodsPCRentsofthelocus.AftercloningthePCRproducts,therebinantplasmidsinat

4、edthemandusedthemastemplateforreamplificationtogeneratethelocusstandardladder.ResultsThesequencingresultsconfirmedthatthesizeandtheconstructionoftheinsertsorphismsofthislocusinYunnanPumipopulationofChinaethodisofhighvalueforforensicDNAtypingtoconstructstandard

5、ladders.DXS6804isrobustforgeicresearchandforensicapplication.　　KEYTEasyVectorSystemⅠ(美国Promega公司)；聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司)；EDTA等其余试剂均为国产分析纯。　　1.1.4仪器台式高速离心机(德国Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000μL)(法国Gilson公司)；三相恒压电泳仪(美国BiaRad公司)；干热器(美国Bellco公司)；旋涡混匀器(

6、日本Tomykogyo公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂)；低温冰箱(-30℃，-70℃)(日本Sanyo公司)；ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。　　1.2方法　　1.2.1制备标准分型物模板DNA通过Chelex100法[5]提取云南普米族群体样本DNA，PCR扩增。反应体系：总体积13μL，2×Taqpolymerasemix6μL，引物1μL(5nmol/L)，DNA2μL，H2O2μL。反应条件见表1。　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，银染显色[67]。从群体样本的扩增产物中

7、，选出了9个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断，制备成PCR再扩增的模板。　　1.2.2PCR再扩增、产物鉴定及纯化将制备好的9份DNA进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。　　1.2.3PCR产物的克隆采用pGEMTEasyVectorSystemⅠ克隆试剂盒，将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5α感受态细胞，选择培养，再用以上的扩增方法筛选出含有正确插入片段的克隆。　　1.2.4重组质粒的DNA

8、测序采用ABI3730全自动遗传分析仪，以质粒公用的M13正向引物对重组质粒的插入片段进行测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(internationalsocietyofforensichaemogeics,ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名[89]。　　1.2.5重组质粒的扩大培养及保存对经测序证实的含有正确等