神经源性膀胱m2受体mrna的变化

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1、神经源性膀胱M2受体mRNA的变化【摘要】目的研究犬脊髓损伤后致神经源性膀胱逼尿肌中毒蕈碱样胆碱受体亚型(M2)受体的变化,探讨M2受体在犬神经源性膀胱逼尿肌的意义。方法建立动物模型,设骶上型、骶下型神经源性膀胱组和对照组,RTPCR法半定量检测膀胱体部逼尿肌M2受体mRNA。结果骶上型组膀胱容量(281.0±26.2)mL,逼尿肌压力(58.5±5.7)cmH2O,膀胱顺应性(4.8±1.1)mL/cmH2O;骶下型组容量(513.2±44.4)mL,逼尿肌压力(40.3±4.1)cmH2O,顺应性(12.2±2.1)mL

2、/cmH2O,2组比较有统计学意义(P<0.05)。对照组逼尿肌压力(43.0±3.9)与骶下组比较无统计学意义。对照组膀胱逼尿肌有M2受体mRNA表达,骶上型组和骶下型组M2受体mRNA较对照组增加(P<0.05),骶上型组明显高于骶下型组(P<0.05)。结论脊髓损伤后神经源性膀胱逼尿肌M2受体增多,骶上型M2受体增多更明显,M2受体可能直接参与骶上型神经源性膀胱逼尿肌无抑制性收缩。【关键词】膀胱神经源性受体毒蕈碱疾病模型动物RNA信使神经源性膀胱是临床常见疾病,临床处理棘手。笔者建立犬神经源性膀胱的骶上

3、和骶下型动物模型,运用RTPCR方法半定量检测正常犬和模型犬膀胱逼尿肌中的M2受体mRNA,探讨其变化与意义。1材料和方法1.1材料1.1.1动物家养杂交雌性犬15只,由中山大学北校区动物实验中心提供并饲养(实验动物许可证号为Scxk粤20030001),体质量(13.5±1.5)kg,随机分为对照组、骶上组和骶下组,各5只。3组间体质量具有可比性。1.1.2仪器尿动力仪(Ⅳ型,美国LifeTech公司);数字减影血管造影机(1000MAX型,日本Toshiba公司);PCR扩增仪(PE9600型,美国PerkinEme

4、r公司);凝胶成像扫描仪(GelDoc2000型,美国BioRad公司)。1.1.3引物M2受体和内参GAPDH引物用Primer软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列如下:M2受体:上游:5'AAGTCAACCGTCACCTCC3'下游:5'ATCCTCCACAGTCCTCAC3'内参GAPDH:上游:5'GATGCTGGTGCTGAGTATGT3'下游:5'CTTCTGGGTGGCAGTGAT3'1.1.4试剂Trizol试剂[宝生物工程(大连)有限公司]。第一链cDNA合成试剂盒(立陶宛

5、Fermentas公司),内含5×ReactionBuffer;dNTPMix(10mmol/L);Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μL);RandomHemamerPrimer(0.2μg/μL);ControlPrime(10pmol/μL);ControlRNA(0.5μg/μL);DEPCtreatedMuLVReverseTranscriptase(200U/μL);RibonucleasEinhibitor(20U/μL)。Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)。琼脂糖,焦碳酸二乙酯(

6、DEPC)(美国Sigma公司)。其他试剂均为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1神经源性膀胱动物造模根据1.2.3标本采集和处理完成上述步骤后,氯胺酮肌肉注射,行下腹正中切口,暴露膀胱,每组每只犬切取膀胱体部约1cm×1cm组织,放入DEPC水处理过的冻存管,立即放入液氮罐保存运输。1.2.4组织总mRNA提取标本逼尿肌肉组织匀浆后,参照RNAisoReagent说明书提取总RNA。1.2.5RTPCRRTPCRcDNA第一链合成各样品RNA取5μL,加入olig(dT)primer1μL,DEPC水补足至12μL。混匀

7、后低速离心,70℃孵育5min,冰浴1min,转入体系中依次加入5×ReactionBuffer4μL,Ribonucleaseinhibitor1μL,10mmon/LNTPmix2μL。混匀后低速离心,37℃孵育5min,加入逆转录酶1μL,42℃孵育60min,70℃孵育10min,冰上冷却1min,-20℃保存。同时还做一管对照RNA的逆转录,步骤剂量同上。PCR反应体系模板2μL,引物(上游)0.5μL,引物(下游)0.5μL,10×Buffer2.5μL,ExTaq酶0.2μL,无菌双蒸水18.8μL,以消毒双蒸水

8、补足25μL。条件:94℃5min→94℃40s→60℃40s→72℃40s,共35个循环;72℃10min。PCR产物10μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳,紫外光凝胶成像并测定其灰度值,与相应的内参照GAPDH比值表示为最终结果。1.3统计学处理数据以x±s表示,采用SPSS1