神经源性膀胱m2受体mrna的变化论文

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1、神经源性膀胱M2受体mRNA的变化论文【摘要】目的研究犬脊髓损伤后致神经源性膀胱逼尿肌中毒蕈碱样胆碱受体亚型(M2)受体的变化,探讨M2受体在犬神经源性膀胱逼尿肌的意义。方法建立动物模型,设骶上型、骶下型神经源性膀胱组和对照组,RTPCR法半定量检测膀胱体部逼尿肌M2受体mRNA。结果骶上型组膀胱容量(281.0±26.2)mL,逼尿肌压力(58.5±5.7)cmH2O,膀胱顺应性(4.8±1.1)mL/cmH2O;骶下型组容量(513.2±44.4)mL,逼尿肌压力(40.3±4.1)cmH2

2、O,顺应性(12.2±2.1)mL/cmH2O,2组比较有统计学意义(P0.05)。对照组逼尿肌压力(43.0±3.9)与骶下组比较无统计学意义。对照组膀胱逼尿肌有M2受体mRNA表达,骶上型组和骶下型组M2受体mRNA较对照组增加(P0.05),骶上型组明显高于骶下型组(P0.05)。结论脊髓损伤后神经源性膀胱逼尿肌M2受体增多,骶上型M2受体增多更明显,M2受体可能直接参与骶上型神经源性膀胱逼尿肌无抑制性收缩。【关键词】膀胱神经源性受体毒蕈碱疾病模型动物RNA信使神经源性膀胱是临床常见疾病,.

3、freelRNA,探讨其变化与意义。1材料和方法1.1材料1.1.1动物家养杂交雌性犬15只,由中山大学北校区动物实验中心提供并饲养(实验动物许可证号为Scxk粤20030001),体质量(13.5±1.5)kg,随机分为对照组、骶上组和骶下组,各5只。3组间体质量具有可比性。1.1.2仪器尿动力仪(Ⅳ型,美国LifeTech公司);数字减影血管造影机(1000MAX型,日本Toshiba公司);PCR扩增仪(PE9600型,美国PerkinEmer公司);凝胶成像扫描仪(GelDoc2000

4、型,美国BioRad公司)。1.1.3引物M2受体和内参GAPDH引物用Primer软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列如下:M2受体:上游:5'AAGTCAACCGTCACCTCC3'下游:5'ATCCTCCACAGTCCTCAC3'内参GAPDH:上游:5'GATGCTGGTGCTGAGTATGT3'下游:5'CTTCTGGGTGGCAGTGAT3'1.1.4试剂Trizol试剂宝生物工程(大连)有限公司。第一链cDNA合成试剂盒(立陶宛Fermentas公

5、司),内含5×ReactionBuffer;dNTPMix(10mmol/L);Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μL);RandomHemamerPrimer(0.2μg/μL);ControlPrime(10pmol/μL);ControlRNA(0.5μg/μL);DEPCtreatedMuLVReverseTranscriptase(200U/μL);RibonucleaseInhibitor(20U/μL)。Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)。琼脂糖,焦碳

6、酸二乙酯(DEPC)(美国Sigma公司)。其他试剂均为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1神经源性膀胱动物造模根据文献1并加以改进。动物麻醉后,沿L4~6棘突间作纵形切口,暴露L4~6棘突,咬除L5棘突及椎骨,暴露脊髓。骶上型以剪刀完全锐性横断L4~5椎间隙水平脊髓;骶下型在横断脊髓后用探针向下完全钝性破坏横断面以下脊髓,并充填无菌明胶海绵。对照组未行手术。1.2.2膀胱尿道造影及尿动力学检测造模3个月后行膀胱尿道造影及尿动力学检测。犬麻醉,仰卧位,膀胱置入8F红色尿管,注入76%复方泛影葡胺溶

7、液,在数字减影机器监视下摄片完成造影。以卵圆钳撑开阴户口,暴露尿道外口。7F膀胱测压管经尿道置入膀胱,注射器抽空膀胱尿液。9F直肠测压管置入直肠,充盈气囊。零点压力定为大气压下耻骨联合水平。排除导管内气体,仪器调零。采用微量输液泵经7F膀胱测压管的顶孔向膀胱内匀速(40mL/min)灌注生理盐水,侧孔连接压力换能器,A:正常;B:骶上型(膀胱容量减少);C:骶下型(膀胱容量增大).以尿道外口出现尿液作为排尿开始的标志,计算机自动测量膀胱容量、逼尿肌压力(膀胱压力直肠压力)及膀胱顺应性(膀胱容量增

8、加值/逼尿肌压力增加值)。1.2.3标本采集和处理完成上述步骤后,氯胺酮肌肉注射,行下腹正中切口,暴露膀胱,每组每只犬切取膀胱体部约1cm×1cm组织,放入DEPC水处理过的冻存管,立即放入液氮罐保存运输。1.2.4组织总mRNA提取标本逼尿肌肉组织匀浆后,参照RNAisoReagent说明书提取总RNA。1.2.5RTPCRRTPCRcDNA第一链合成各样品RNA取5μL,加入olig(dT)primer1μL,DEPC水补足至12μL。混匀后低速离心,70℃孵育5min,冰