crkl基因反义寡核苷酸对k562细胞增殖的影响论文

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1、CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响论文.freelylocyticleukemiaAbstract:AIMToinvestigatetheeffectsofCRKLanti-sense-oligonucleutides（ASODN）oncellgroediatedbycationinli-posome.Thecellviability，proliferation，andgeneexpres-sioninedbyH3-TdRdopingandRT-PCR.RE┐SULTSCRKLASODNcouldinhibittheviabilityandp

2、rolif-erationofK562cells.CONCLUSIONCRKLgenemayplayakeyroleinthepathogenisisinPh+CML.0引言性粒细胞性白血病（CML）是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病.绝大多数CML具有特征的Ph染色体（Ph+CML），有其形成的bcr-abl融合基因，编码的P210bcr-abl融合蛋白具有异常增高的酪氨酸激酶活性，通过异常激活RAS、JAK/STAT、JUN等激酶，引起调控细胞生长、发育的多条信号转导途径异常，从而使细胞发生恶性转化［1］.CRKL系bcr-abl通路中一个重要

3、接头蛋白，为bcr-abl融合蛋白激酶的主要底物之一.我们通过CRKL基因反义寡核苷酸作用于Ph+的K562细胞，观察对其增殖活性的影响，以探讨CRKL基因在CML发病中的作用.1材料和方法1.1反义寡核苷酸针对翻译起始位点的反义寡核苷酸［2］ASODN:5′-GTCGAACCTGGCGGAGGA-3’（18bp）;无意义寡核苷酸NASODN:5′-GAAGGGCTTCTGCGTC-3′（16bp）.上述寡聚物均为全硫代修饰，由上海Sangon公司合成，纯化后-20℃保存.1.2阳离子脂质转染剂美国Gibco公司产品，本校西京医院刘颖格博士惠赠.转染步骤按

4、照产品说明书进行.1.3细胞系及培养条件K562细胞由本校病理学教研室惠赠.用RPMI1640完全培养液（含100mLL-1灭活胎牛血清），置于37℃，50mLL-1CO2饱和湿度的恒温孵箱中培养.实验选用对数生长期细胞.选用96孔板，分3组:ASODN组，NASODN组及空白对照组.每组设4个复孔，每孔接种细胞5×104个.分别加入脂质体包裹的终浓度为2，3，5mgL-1的A-SODN及NASODN，空白对照组加入相同量的培养液及脂质体.最后以浓度5mgL-1的寡核苷酸培养细胞，分别于24，48，72，96h测细胞活性，绘制细胞生长曲线，计算细胞生长抑制

5、率.1.4反义核酸对K562细胞增殖活性的影响采用H3-TdR掺入法.结果应用重复观察数据统计分析法进行分析.1.5CRKL基因表达的检测采用RT-PCR法，并以β-actin为内［对照，收集各组处理72h后的K562细胞，采用Trizol试剂盒（购自Gibco公司）提取总RNA，引物由上海Sangon公司合成，β-actin引物为本校生化教研室柴玉波博士惠赠.引物序列［3］如下:CRKL基因5′端引物:5′-ACAGCAGAAGATAACCTG-3′;3′端引物:5′-CCCAAGCTTTTCTGGATTGCTTTCGC-3′（扩增产物为355bp）;β

6、-actin5′端引物5′-CCACTGAAAAAGATGAGTAT-3′;3′端引物:5′-CTTCAACCTCCATGATGCTGCTG-3′（扩增产物为112bp）.1.5.1逆转录（20μL体系）500mgL-1的oligo（dT）12-183μL，10mmolL-1的dNTPmix1μL，总RNA5μg，5×逆转录缓冲液4μL，0.1MDTT2μL，4×107IUL-1RNA酶抑制剂1μL，200IU的M-MLV（鼠源性逆转录酶）1μL，加DEPC-ddH2O至20μL后置混合物于37℃水浴50min，最后于70℃灭活15min.（上述反应物均购

7、自华美公司）.1.5.2PCR采用100μL反应体系10×缓冲液（不含Mg2+）10μL，15mmolL-1的MgCl210μL，2.5mmolL-1dNTP2μL，cDNA2μL，taq酶1μL（5×106IUL-1），CRKL引物，β-actin引物各20pmol，加水至100μL，各反应物均购自Takara公司.扩增条件:扩增前94℃变性5min;循环条件为94℃40s，54.5℃45s，72℃延伸40s，扩增35个循环;扩增最后72℃延伸7min.1.5.3电泳20mgL-1琼脂糖凝胶，溴化乙锭（EB）0.5mgL-1，PCR产物各10μL，电泳在

8、75V电压下进行50min，紫外照相.2结果2.1反义核酸对K56