survivin反义核酸治疗人大肠癌裸鼠皮下种植瘤的实验研究宫向前

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1、Survivin反义核酸治疗人大肠癌裸鼠皮下种植瘤的实验研究宫向前乔广东李玉华邢建华寿楠海丁印鲁【摘要】目的：探讨Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人大肠癌皮下种植瘤体生长的抑制作用及其机制。方法：接种人大肠癌细胞制作裸鼠皮下大肠癌种植瘤模型，分别用Survivin反义寡核苷酸、正义核苷酸和生理盐水对皮下瘤体内直接进行注射治疗，检测肿瘤的生长状况、瘤体体积及瘤重变化，计算抑制率。病理切片免疫组化检测瘤体ECD表达。结果：经Survivin硫代反义寡核苷酸治疗组裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制，肿瘤重量明显小于对照组，肿瘤体积

2、明显小于对照组和正义组（P＜0.05），裸鼠皮下移植瘤ECD表达增强。结论：Survivin反义核酸可以抑制大肠癌裸鼠移植瘤的生长，Survivin反义核酸抑制大肠癌裸鼠移植瘤生长的机理可能与ECD基因表达变化有关。【关键词】寡核苷酸类，反义・基因，Survivin・结直肠肿瘤・小鼠，裸【ABSTRACT】Objective:Tostudytheinhibitoryeffectofsurvivinantisenseoligodeoxynucleotidesongroancolorectalcarcinomainnude

3、mice.Methods:Humancolorectalcarcinomatransplantedsubcutaneouslyinnudemicemodeliceelycontrolgroup,survivinSODNgroupandsurvivinASODNgroup.Differenttreatmentseofthesubcutaneoustumorseasured,andthemorphologyoftumorinedimmunohistochemicallyinthehumancolorectalcancert

4、ransplantedsubcutaneouslyinnudemice.Results:ThegroeofthesubcutaneoustumorsinsurvivinASODNgroupissmallerthanincontrolgroup.AndtheexpressionofEcadherinisstongerintheASDONgroupthanincontrolgroup.Conclusion:Survivinantisenseoligodeoxynucleotidesarepoancolorectalcarc

5、inomainnudemice.ThechangeofEcadherin,anothertumorrelatedgene,mayplayanimportantroleinthisprogress.【KEYice,node研究表明，肿瘤的发生发展与基因缺失、突变或异常表达有关，因此基因疗法为肿瘤治疗提供了新的途径〔1〕。我们以Survivin基因为靶基因，探讨了其反义寡核苷酸对裸鼠人大肠癌生长的抑制作用及机制。1材料与方法1.1细胞培养HT29结肠腺癌细胞株为中分化Ⅱ级上皮样细胞。于含10%小牛血清的RPMI1640培养

6、液（PH7.27.4,Gibico,U.S.A)培养瓶中培养，内含青霉素和链霉素各100U/ml，单层培养于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中。0.25%胰蛋白酶消化，传代后处于指数生长期备用。实验用细胞经0.4%台盼蓝染色，拒染率＞95%。1.2核苷酸链的人工合成设计反义寡脱氧寡核苷酸链（ASODN），所有序列经同源性序列检测未发现与人类其他基因同源。其序列如下：5’GGCAACGTCGGGGCACCCAT3’，正义寡脱氧核苷酸（SODN）作为对照，其序列如下：5’GCCATCGTAGGGGATCGCTT3’。以上寡

7、脱氧核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成，均为硫代磷酸型。冻干分装并保存-20℃冰箱中。1.3裸鼠大肠癌模型的建立BALC/C，nu/nu裸小鼠，5~6周龄，雌性，体重19~22g，购于中国医学科学院实验动物繁育厂，饲养于SPF级无菌饲养室。HT29大肠癌细胞经细胞培养处于指数生长期。消化、吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞液调整为细胞浓度为2.5×107/ml，每只裸鼠接种0.2ml单细胞悬液于一侧背部皮下。以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准，2周左右成瘤，成瘤率为100%(24/24)。1.4反义核酸抑制种

8、植瘤试验取种植成瘤后的裸鼠24只，称重量后根据体重随机分成3组，每组8只，分组及治疗情况如下：反义核苷酸治疗（ASODN组）每日于瘤体内多点注射SurvivinASODN,100μg/只。正常组（SODN组）和对照组：分别同法注射SurvivinSODN100μg/只和200μl/只的生理盐水。SODN与ASODN体积均为0.2m