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1、氯氨酮对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡和Fas蛋白、Bcl论文【关键词】心肌缺血再灌注损伤；,,心肌细胞凋亡；,,氯胺酮；,,Fas蛋白；,,Bcl摘要：目的：探讨氯胺酮作用下大鼠实验性心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas及Bcl2蛋白表达的变化及与心肌组织损伤的关系，并分析心肌组织病理学损伤程度。方法：以穿线结扎或松扎左冠状动脉制备大鼠心肌缺血再灌注模型。32只大鼠随机分成假手术组(假手术4.5h)、缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4h)、低剂量氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4h)及高剂量氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注个4h)。以缺
2、口末端标记法检测心肌细胞凋亡的变化,SP免疫组化法分别检测Fas与Bcl2蛋白水平变化，做病理组织切片检查心肌损伤情况。结果：心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数及Fas蛋白阳性染色指数与Bcl2蛋白阳性染色指数均增加,氯氨酮可减少心肌凋亡，减少Fas和Bcl2蛋白阳性细胞表达;心肌缺血再灌注后心肌组织呈大小不一的灶性坏死,坏死周围有炎性细胞浸润，氯胺酮作用后坏死减轻，低剂量氯胺酮作用更明显。结论：心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡、Fas基因的蛋白与Bcl2蛋白表达量均增加,氯氨酮可减少心肌凋亡,.freel公司,兔抗鼠Fas多克隆抗体及FasL多克隆抗体均购自SantaC
3、ruz公司。SABC试剂盒购自于博士德公司。12实验动物及分组雄性健康SD大鼠（6个月左右）32只，由长江大学医学院实验动物中心提供,体重250~300g,随机分为4组，每组8只。A组为假手术对照组；B组为缺血再灌注模型对照组；C组为2mg/kg氯胺酮+缺血再灌注模型组;D组为4mg/kg氯胺酮+缺血再灌注组。13动物模型制备10%水合氯醛40mg/kg腹腔注射麻醉，连接多功能监护仪记录Ⅱ导心电图；气管切开，接小型动物呼吸机进行机械通气，呼吸频率60次/分，潮气量2ml/100g，于左胸第四肋间打开胸腔暴露心脏，在左心耳1mm左冠状动脉处，用眼科外用不锈小圆针穿过心
4、肌浅层，稳定10min后将U型含有铜丝的胶管置于冠状动脉表面一起结扎（A组不结扎，B、C、D组结扎）；结扎开始左心室心尖部即由红色变暗，30min后呈暗红色，心电图中出现ST段抬高，说明缺血形成。此时B、C、D组分别由右腹股静脉注入10mL/kg生理盐水、2mg/kg氯胺酮、4mg/kg氯胺酮,解开结扎线后进行再灌注。在再灌注4h后断头处死，将新鲜心肌组织标本放入40g/L中性甲醛溶液中固定,然后集中进行石蜡包埋,切片于4℃冰箱保存备用。14凋亡细胞原位标记与半定量分析石蜡包埋的心肌组织,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法检测。
5、结果根据凋亡阳性细胞分布情况,每张切片拍摄5个阳性视野,每视野记数300个心肌细胞中阳性细胞数,以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。15Fas基因和Bcl2基因蛋白表达检测与半定量分析取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5张，采用链霉亲和素生物素过氧化酶复合物技术(SABC)法进行免疫组化染色和HRP/AEC显色法。每张切片于阳性表达区域选择10个无重叠视野,用图像分析仪进行分析,并计算其光密度值的均值。采用光密度值的均值×102表示。16心肌组织病理学分析切片于HE染色后观察其组织病理性损伤改变。17统计学处理采用SPSS软件进行统计学分析,
6、多组间比较用单因素方差分析，q检验进行组间比较，P0.05为差异有显著性。2结果21心肌凋亡细胞计数心肌组织中凋亡细胞的分布及变化:经TUNEL染色及苏木素复染后凋亡细胞核呈棕色,正常细胞核染蓝色。假手术组仅见极少数散在的凋亡细胞;心肌缺血再灌注后凋亡细胞数明显增加,氯氨酮作用后凋亡细胞数明显下降,且低剂量氯氨酮作用组下降更多。见表1。22心肌组织中Fas和Bcl2基因的蛋白阳性染色变化假手术组仅见极少数散在的Fas蛋白阳性染色细胞和Bcl2蛋白阳性染色细胞;心肌缺血再灌注后Fas和Bcl2蛋白阳性染色的细胞增加,Fas和Bcl2蛋白阳性细胞多为位于心肌梗死区周围的
7、心肌细胞,氯氨酮作用后Fas蛋白和Bcl2蛋白阳性细胞数较缺血再灌注组减少,低剂量组减少更多。见表2。表1各组大鼠心肌细胞凋亡变化(略)表2大鼠心肌组织Fas与FasL蛋白阳性染色细胞指数的变化(略)23心肌组织病理学改变假手术组心肌组织未见细胞变性和坏死;心肌缺血再灌注各组均有明显的心肌细胞浊肿灶性坏死,甚至可见多个相互连接的坏死灶。氯胺酮作用组细胞坏死情况减轻，坏死灶减少，低剂量氯胺酮作用组减轻程度更多。3讨论研究表明，心肌缺血再灌注过程中除了细胞坏死外，还有另外一种细胞死亡形式即细胞凋亡［1］。早在90年代就有研究证实心肌缺血再灌注能引起心肌细胞凋亡［2］
