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1、氯氨酮对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡和Fas蛋白、Bcl【关键词】心肌缺血再灌注损伤；,,心肌细胞凋亡；,,氯胺酮；,,Fas蛋白；,,Bcl 摘要：目的：探讨氯胺酮作用下大鼠实验性心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas及Bcl2蛋白表达的变化及与心肌组织损伤的关系，并分析心肌组织病理学损伤程度。方法：以穿线结扎或松扎左冠状动脉制备大鼠心肌缺血再灌注模型。32只大鼠随机分成假手术组(假手术4.5h)、缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4h)、低剂量氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4h)及高剂量
2、氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注个4h)。以缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡的变化,SP免疫组化法分别检测Fas与Bcl2蛋白水平变化，做病理组织切片检查心肌损伤情况。结果：心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数及Fas蛋白阳性染色指数与Bcl2蛋白阳性染色指数均增加,氯氨酮可减少心肌凋亡，减少Fas和Bcl2蛋白阳性细胞表达;心肌缺血再灌注后心肌组织呈大小不一的灶性坏死,坏死周围有炎性细胞浸润，氯胺酮作用后坏死减轻，低剂量氯胺酮作用更明显。结论：心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡、Fas基因的蛋白与Bcl2蛋
3、白表达量均增加,氯氨酮可减少心肌凋亡,减少细胞Fas和Bcl2蛋白阳性表达,从而减轻心肌损伤，且低剂量氯氨酮作用更明显。 关键词：心肌缺血再灌注损伤；心肌细胞凋亡；氯胺酮；Fas蛋白；Bcl2蛋白 细胞凋亡不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式,它是一个受遗传基因调节的生理学细胞自杀过程或程序性细胞死亡［1］。研究表明在心肌缺血再灌注过程时，大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量中性粒细胞浸润以及线粒体损伤等均可促进心肌细胞凋亡，造成心肌损伤。而细胞凋亡中,凋亡刺激基因的蛋白表达产物Fas蛋白及抗凋亡因子Bc
4、l2蛋白的作用被认为中有重要意义。有研究表明氯胺酮可抑制心肌缺血再灌注损伤，但对其是否抑制心肌中的细胞凋亡并不清楚。本实验研究氯胺酮对其作用下大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas及Bcl2蛋白表达量的变化及与心肌组织损伤的关系。 1材料与方法 11实验材料与仪器小型动物呼吸机(浙江大学实验仪器厂),心电图检测仪(浙江大学实验仪器厂)。细胞凋亡原位检测试剂盒(InSituCellDeathDetectionKit,POD)购自BoehringerMannhEim公司,兔抗鼠Fas多克隆抗体及FasL多克
5、隆抗体均购自SantaCruz公司。SABC试剂盒购自于博士德公司。 12实验动物及分组雄性健康SD大鼠（6个月左右）32只，由长江大学医学院实验动物中心提供,体重250~300g,随机分为4组，每组8只。A组为假手术对照组；B组为缺血再灌注模型对照组；C组为2mg/kg氯胺酮+缺血再灌注模型组;D组为4mg/kg氯胺酮+缺血再灌注组。 13动物模型制备10%水合氯醛40mg/kg腹腔注射麻醉，连接多功能监护仪记录Ⅱ导心电图；气管切开，接小型动物呼吸机进行机械通气，呼吸频率60次/分，潮气量2ml/100
6、g，于左胸第四肋间打开胸腔暴露心脏，在左心耳1mm左冠状动脉处，用眼科外用不锈小圆针穿过心肌浅层，稳定10min后将U型含有铜丝的胶管置于冠状动脉表面一起结扎（A组不结扎，B、C、D组结扎）；结扎开始左心室心尖部即由红色变暗，30min后呈暗红色，心电图中出现ST段抬高，说明缺血形成。此时B、C、D组分别由右腹股静脉注入10mL/kg生理盐水、2mg/kg氯胺酮、4mg/kg氯胺酮,解开结扎线后进行再灌注。在再灌注4h后断头处死，将新鲜心肌组织标本放入40g/L中性甲醛溶液中固定,然后集中进行石蜡包埋,切片于
7、4℃冰箱保存备用。 14凋亡细胞原位标记与半定量分析石蜡包埋的心肌组织,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法检测。结果根据凋亡阳性细胞分布情况,每张切片拍摄5个阳性视野,每视野记数300个心肌细胞中阳性细胞数,以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。 15Fas基因和Bcl2基因蛋白表达检测与半定量分析取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5张，采用链霉亲和素生物素过氧化酶复合物技术(SABC)法进行免疫组化染色和HRP/AEC显色法。每张切片于阳性表达
8、区域选择10个无重叠视野,用图像分析仪进行分析,并计算其光密度值的均值。采用光密度值的均值×102表示。 16心肌组织病理学分析切片于HE染色后观察其组织病理性损伤改变。 17统计学处理采用SPSS软件进行统计学分析,多组间比较用单因素方差分析，q检验进行组间比较，P<0.05为差异有显著性。 2结果 21心肌凋亡细胞计数心肌组织中凋亡细胞的分布及变化:经TUNEL染色及苏木素复染后凋
