有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及bcl2和

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1、有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2和【摘要】目的探讨有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响。方法建立衰老大鼠模型，随机分为对照组和两组运动组，运动组分别给予6次/in，训练12g/kg，青年组腹部注射相同剂量的生理盐水。连续注射42d。青年组、自然衰老组和单纯模型组（随机选取模型组8只）禁食12h后处死，取左心室游离壁全层心肌组织，TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，判断造模是否成功〔3，4〕。1.3造模后分组及运动训练造模成功后，衰老模型SD大鼠随机分为3组，为对照组，3

2、次/in，水温31℃～33℃，水深60cm，人工控制大鼠不停地游泳。对照组放入同样温度的浅水中，以避免水温对大鼠产生的刺激差异，第1天游泳时间为30min，以后每天增加10min，直至达到90min后，保持不变。每次训练结束后，动物能自己抖干身上的水，无疲劳症状出现，共训练12ershamBiosciences)。1.4.2标本收集末次运动后48h，断颈处死大鼠。取左心室前壁全层心肌组织，分为两份，一份即刻存至-70℃冰箱，用作免疫印迹检测；一份用4%多聚甲醛固定24h后蔗糖沉淀过夜，取左心室近心尖处心肌组织作1

3、0μm厚冰冻切片，每个标本取两张不连续切片，用作TUNEL检测。1.4.3TUNEL法检测心肌细胞凋亡新鲜配制3%双氧水室温处理标本片10min，取TDT和DIGdUTP各1μl加入18μl标记缓冲液滴加于切片，37℃标记2h；封闭液封闭室温30min，生物素化抗地高辛抗体37℃反应30min；SABC稀释液反应30min，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞核呈棕黄色。每只大鼠观察两张切片，每张切片计数5个高倍视野(×400)中的凋亡阳性细胞数。凋亡指

4、数（apoptosisindex，AI）＝凋亡阳性细胞数/总细胞数。1.4.4免疫印迹法检测心肌组织中Bax、Bcl2的表达①蛋白样品的制备：取冻存的心肌标本100mg，加裂解液1ml及PMSF，proteaseinhibitorcocktail，phosphataseinhibitorcocktail各10μl，冰上匀浆30min，4℃12000r/min离心15min,取上清，测定蛋白浓度后与等体积2×上样缓冲液混匀后煮沸3min，-20℃保存以备用。②免疫印迹：按照实验室常规方法配制10%SDSPAGE

5、，以总蛋白量30μg/lane上样，电泳；转膜，以1∶400鼠抗bax单克隆抗体或1∶400鼠抗Bcl2单克隆抗体及1∶5000辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG孵育，用ECL发光剂显示阳性条带,在Ty2phoon分子成像系统上记录结果。以βactin为内参照，目标蛋白条带及βactin条带为同次电泳所得，以两者的比值进行半定量。1.5统计学处理使用SPSS13.0统计软件，实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理。2结果2.1衰老模型制备的结果TUNEL染色结果显示，青年组心肌细胞AI(4.132

6、±0.308)‰，自然衰老组心肌细胞AI〔(33.692±2.667)‰〕及单纯模型组〔(34.146±2.931)‰〕较青年组明显增多(P＜0.01)，而自然衰老组与单纯模型组无明显差异。见图1。2.2各组大鼠心肌细胞凋亡和Bcl2、Bax检测结果与对照组相比，两组运动组心肌细胞AI均显著降低（P＜0.01），Bcl2显著升高（P＜0.01），Bax降低（P＜0.05），Bcl2/Bax显著升高（P＜0.01）；与6次/w运动组相比较，3次/w运动组心肌AI降低（P＜0.05），Bcl2升高（P＜0.0

7、5），Bax降低（P＜0.05），Bcl2/Bax升高（P＜0.05），见图2、图3、表1。表1对照组及两组运动组大鼠心肌细胞AI和Bcl2、Bax检测结果3讨论3.1D半乳糖衰老模型的建立及检测心肌细胞凋亡在青年期即可发生，随着增龄,心肌细胞凋亡的发生也逐渐增高,并且局限于左心室游离壁心肌细胞。24月龄小鼠与16月龄小鼠相比较,左心室心肌细胞凋亡发生率增加近2倍。心肌凋亡率的随龄性增加使得衰老小鼠心肌细胞数量较青年小鼠减少30%〔5〕。因此心肌细胞凋亡情况可以用作衰老的检测。本实验TUNEL法检测结果发现

8、，衰老模型大鼠心肌细胞AI与自然衰老大鼠相似，均明显高于青年组大鼠，显示造模成功。3.2运动与心肌细胞凋亡研究表明细胞凋亡是受基因调控的精确过程，其中Bcl2蛋白家族成员在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，Bcl2家族可以分为两大类:一是抗凋亡的,主要有Bcl2、BclXL、Bclcl1(myeloidcellleukemia1)、CED9等;二是促细胞死亡