生物化学实验技术

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1、实验一3,5-二硝基水扬酸比色法测定还原糖和总糖一、目的掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理和方法，并用此法测定山芋粉中的总糖和还原糖。二、原理糖的测定方法有物理的和化学的两类。物理方法是通过其折光率、比旋度的变化来进行测定，也可利用比重计进行测定。比较精确和常用的方法是化学测定法。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖就是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原性糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖。利用单糖、双糖与多糖的溶解度不同可把它们分开，并且可用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成具有

2、还原性的单糖，再进行测定，这样就可以分别求知样品中总糖和还原糖的量。本实验是利用3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物。在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色强度成正比。因此，利用分光光度计进行比色测定，即可求得样品的含糖量。此法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰少。三、实验步骤1.葡萄糖标准曲线的制作取6支比色管，分别按下表顺序加入各种试剂：将各管混匀后，在540nm波长下，用0号管调零，分别读取各管的光密度值；数量管号项目空白12345含糖总量（mg）00.20.40.60.81.0葡萄糖标准液（

3、ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.0DNS试剂（ml）1.51.51.51.51.51.5146混匀后在沸水浴中加热5分钟，立即用流动水冷却。加蒸馏水稀释至25毫升刻度线。以光密度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标绘制标准曲线。2．样品中还原糖和总糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准确称取1克山芋粉，放入大试管中。先以少量水调成糊状，然后加30毫升蒸馏水，搅匀，在50℃恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。抽滤或离心，用少量蒸馏水洗涤残渣。将滤液收集在100毫升的容量瓶中，

4、用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取0.2克山芋粉，放入大试管中。用移液管加入5毫升6mol/LHC1，8毫升蒸馏水，摇匀后在沸水浴中加热30分钟，用流动水冷却后，用6mol/LNaOH中和至中性，抽滤或离心，滤液用蒸馏水定容到100毫升容量瓶中，此为总糖待测液。使用时把它稀释一倍再按量进行。（3）样品中含糖量的测定：取5支比色管，编号，按下表加入各种试剂：数量管号项目空白还原糖测定管总糖测定管ⅠⅡ①②还原糖待测液（毫升）01.01.000总糖待测液（毫升）00201.01.0蒸馏

5、水（毫升）2.01.01.01.01.0DNS试剂（毫升）1.51.51.51.51.5将上述各管混匀，其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同，测定各管光密度值。四、结果与计算：将2管光密度值平均后在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下列公式计算样品中还原糖和总糖百分含量。146五、实验材料、仪器和试剂1.实验材料：山芋粉2.试剂（1）1毫克/毫升葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯葡萄糖（预先在105℃烘干至恒重）置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100毫升的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀、冰箱保存备用。（2

6、）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：甲液——溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。乙液——称取255克酒石酸钾钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，在加入880毫升1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲液与乙液即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7～10天以后使用。（3）6mol/LHCL（4）6mol/LNaOH3.器材（1）容量瓶（100毫升）×2，（25毫升）×1（2）移液管（1毫升）×4，（5毫升）×2（3）量筒（100毫升）×1（4）移液管架（

7、5）试管×5（6）大试管×2（7）标签纸×4（8）滴管×2（9）玻棒×2（10）抽滤瓶或离心机(11)擦镜纸（12）吸耳球（13）72型分光光度计（14）水浴锅（15）称量纸（16）烧杯（50毫升或100毫升）×1146实验二酵母蔗糖酶的提取及动力学分析本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。自1860年Bertholet从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（

8、b—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的a—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。本实验提取干酵母中的