钙拮抗剂通过tnf-α2fnf-κb环路介导的非钙通道阻断作用抗心肌细胞缺氧复氧损伤的研究

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1、万方数据万方数据汕头大学硕士学位论文摘要钙拮抗剂（Calciumantagonists）是一类选择性阻止电压依赖性钙通道，抑制细胞外Ca2+内流，降低细胞内Ca2+浓度的药物。按照化学结构，钙拮抗剂主要分为3类：二氢吡啶类，硫氮杂卓类，苯烷胺类。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butylhaloperidoliodide，F2）是我课题组研究合成的一个新化合物。前期研究表明，F2有拮抗钙超载保护心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤或心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/re

2、oxygenation,H/R）损伤的作用。F2能够激活非钙依赖型PKCε转位，保护心肌细胞H/R损伤；此外，在L-型钙通道缺失的心脏微血管内皮细胞上，F2对H/R损伤依然有保护作用。文献报道，地尔硫卓、氨氯地平和维拉帕米可通过不依赖于改变细胞内钙浓度的途径影响转录因子NF-IL6和NF-κB的活性。上述研究结果提示，钙拮抗剂对心肌细胞H/R损伤具有非钙依赖的保护机制。肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）作为一种多功能的细胞因子，在炎症反应、免疫应答等多种生理、病理

3、过程中发挥着重要作用。有文献报道，心肌I/R及心肌细胞H/R刺激下，TNF-α激活且表达上调是导致心肌功能紊乱的一重要因素。结合前期的基因芯片数据，在无钙液H/R模型中，TNF-α表达上调，F2处理后TNF-α表达下调。提示我们，TNF-α可能参与无钙液H/R引起的心肌损伤。因此，本研究首先通过观察无钙液条件下H/R心肌细胞中TNF-α的变化，及钙拮抗剂对TNF-α表达的影响；进一步探讨无钙液H/R时，H9C2心肌细胞是否介导TNF-α/NF-κB环路以及钙拮抗剂是否可以通过调节此环路保护心肌细胞H/R损

4、伤。方法：第一部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α表达的影响1.将培养的H9C2心肌细胞随机分组：①对照(Ca2+1h)组；②无钙液(0Ca2+)组；③无钙液缺氧复氧（0Ca2+H/R）组；④无钙液+不同钙拮抗剂组；⑤无钙液+DMSO组；⑥无钙液H/R+DMSO组；⑦无钙液H/R+不同剂量钙拮抗剂组。2.Real-TimePCR方法检测H9C2心肌细胞中TNF-αmRNA水平。3.ELISA方法检测H9C2心肌细胞培养上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10浓度。4.线粒体膜电位（JC-1）方

5、法检测H9C2心肌细胞早期凋亡。I万方数据汕头大学硕士学位论文1.比色法检测H9C2心肌细胞中乳酸脱氢酶（LDH）含量。第二部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α/NF-κB环路的影响1.将培养的H9C2心肌细胞随机分组：对照（Ca2+1h）组、无钙液1h(0Ca2+1h)组、无钙液H/R组、无钙液H/R+DMSO组、无钙液H/R+F2组、无钙液H/R+Ver组、无钙液H/R+Dil组、无钙液H/R+Nif组、无钙液H/R+F2+TNF-α组、无钙液H/R+Ver+TNF-α组、无钙液H/R+TN

6、F-α组、无钙液H/R+anti-TNF-αmab组、无钙液1.0h+TNF-α组、无钙液H/R+PDTC组、无钙液H/R+LPS组,、control+P65组、control+vecter组。2.ELISA方法检测H9C2心肌细胞培养上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10浓度。3.Western-blot法检测无钙液H/RH9C2心肌细胞p-P65，P65，p-IKB-α，IKB-α，p-IKKα/β，IKKα/β蛋白表达的变化。4.线粒体膜电位（JC-1）方法检测H9C2心肌细胞早期凋亡。5.比色

7、法检测H9C2心肌细胞中LDH含量。6.双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase)检测H9C2心肌细胞NF-κBLuciferase，TNF-αpromoterLuciferase荧光比值。7.免疫荧光检测H9C2心肌细胞NF-κB的核转位。结果：第一部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α表达的影响1.无钙液培养可刺激H9C2心肌细胞生成TNF-α，无钙液培养1h后随着培养时间的延长释放生成的TNF-α含量逐步升高，钙拮抗剂对无钙液培养所致TNF-α升高无影响。无钙液中加入H0.5h/R

8、0.5h刺激，可明显激活H9C2心肌细胞释放TNF-α，随着无钙液H/R时间的延长，培养液中TNF-α含量逐步升高。同时，无钙液H/R可促进H9C2心肌细胞释放IL-6，LDH及减少IL-10的生成。不同浓度的F2及Ver可剂量依赖地下调无钙液H/R所致心肌细胞TNF-α，IL-6，LDH含量的升高及IL-10的降低，而Dil，Nif对TNF-α表达上调无影响。2.F2及Ver能剂量依赖地抑制无钙液H/R所致H9C2心肌细胞中