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1、琥珀酸对原代心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用［摘要］本研究采用SD大鼠乳鼠心肌细胞原代培养,复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型，考察琥珀酸对心肌细胞缺氧复氧损伤的LDH漏出率的影响，并进一步采用流式细胞术及Westernblot考察琥珀酸对心肌细胞凋亡，cleavedcaspase-3及p-Akt的影响，探讨琥珀酸对新生大鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。研究结果发现：①琥珀酸31、25〜500mg-L-1对原代心肌细胞活力无明显影响，琥珀酸400,200,100,50mg-L-1均可显著降低心肌细胞缺氧复氧损伤LDH漏出率（PIC二（
2、A0、5%DMS0组-A加药组）/A0、5%DMS0组X100%2、3心肌细胞缺氧复氧损伤模型及体外加药参考文献复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型［5-7］,具体如下：①缺氧:取出35mm培养皿，弃去培养液，无糖台氏液洗细胞3次，每孔加入预先以95%N2-5%C02混合气饱和15min的无糖台氏液2mLo将培养皿敞盖放入自制缺氧盒中，通入95%N2-5%C02混合气（流速1L•min-1）,通气15min后，夹闭进气管和出气管并将缺氧盒置于细胞培养箱内3h进行缺氧。②复氧：打开缺氧盒，取出培养皿，吸出缺氧液，每皿加入2mL含2、5%胎牛
3、血清的DMEM液，置培养箱内继续培养2h（用于LDH检测）或6h（用于流式，cleavedcaspase-3,Akt及p-Akt蛋白表达）。药物以DMSO溶解，按照1：1000的比例加入培养上清液，分别在缺氧开始和复氧开始时各加药1次。正常组细胞给予含相应DMSO及糖的台氏液，培养3h后，更换含2、5%胎牛血清的DMEM培养液继续培养2h或6h。2、4LDH释放实验分成正常组、模型组、阳性药地尔硫卓45mg•L-1组、琥珀酸400,200,100,50mg•L-1组。复氧结束后，取出各组细胞复氧液，每皿加入2mL超纯水，-70°C
4、低温冰箱冻融1次裂解细胞，取各组细胞裂解液。釆用酶反应动力监测法测定各组缺氧液、复氧液、裂解液的LDH含量，按下列公式计算LDH漏出率。LDH漏出率二（缺氧末上清LDH含量+复氧末上清LDH含量）/（缺氧末上清LDH含量+复氧末上清LDH含量+裂解液中LDH含量）X100%2、5流式检测实验分成正常组、模型组、琥珀酸400,200mg•L-1组。细胞复氧结束后，PBS洗细胞2遍，加入0、25%胰酶（500uL/皿）消化8min,加入500uL心肌细胞培养液终止消化，收集细胞，1000r•min-1离心5min,弃上清，加入1Xbi
5、ndingbuffer400uL重悬细胞至1X106个/mL,取200uL细胞溶液（约1X105个细胞）至5mLEP管，并分别加入5uLFITC-AnnexinV及5uLPI,混匀，常温避光15min,上机分析。2、6cleavedcaspase-3,Akt,p~Akt蛋白表达实验分成正常组、模型组、琥珀酸400,200mg-L-1组。细胞复氧6h后，弃培养液，PBS洗2遍，加入RIPA(临用前加入PMSF及磷酸酶抑制剂)裂解液60uL,冰上裂解30min,收集细胞，12000Xg,4。(2离心5min,取上清，BCA法测定蛋白浓
6、度，95°C沸水进行蛋白变性，样品-80£保存。20ug蛋白上样，采用5%浓缩胶和12%分离胶进行恒压电泳(浓缩胶：50V；分离胶：100V),100V恒压转移75min(cleavedcaspase~3)或95min(Akt和p~Akt),5%BSA封闭1h,rabbitanti-cleavedcaspase-3(1:500),rabbitanti-Akt(1-1000)andrabbitanti-p-Akt(1：2000)，mouseanti-a-actin(1:2000)4°C孵育过夜，TBST洗膜9minX6次，5%BSA
7、封闭30min,抗兔二抗(1：4万，针对目的蛋白)或抗小鼠二抗(1:4万，针对a-actin)室温孵育30min,TBST洗膜9minX6次，进行化学发光显影及ImageLab软件分析。2、7统计方法采用SPSS18、0统计软件单因素方差分析(ANOVA)进行统计，数据以土s表示，组间差异采用Student-Newman-Keu1s(SNK)进行比较，P图1琥珀酸抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞cleavedcaspase-3蛋白表达Fig、1Effectofsuccinicacidonexpressionofcleavedcaspas
8、e—3incardiomyocytessubjectedto3hhypoxiafollowedby6hreoxygenation3、5琥珀酸对缺氧复氧诱导的心肌细胞Akt,p-Akt蛋白表达的影响各组间Akt蛋白表达变化无明显差异。与正常组相比，模
