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1、人外周血树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的鉴定论文【关键词】树突状细胞【关键词】树突状细胞；外周血；共刺激分子0引言树突状细胞(dendriticcells,DC)的特点及功能是目前肿瘤免疫研究的热点，本研究将在DC的培养及其表面标记等方面做进一步的探讨,为DC的进一步研究奠定基础.1材料和方法1．1材料重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重组人白细胞介素4(IL4)，肿瘤坏死因子α(TNFα)均购自深圳晶美公司,FITC标记的单抗：CD83，CD40，HLADR，CD86购自深圳晶美公司.淋巴细胞
2、分离液(上海试剂二厂),小牛血清(杭州四季青生物工程公司).仪器：美国B2D公司FACSCalibur流式细胞仪,Nikon荧光显微镜.1．2方法室温下将25mL的富含白细胞的血液成分与等量淋巴细胞分离液混合，使用FicollHypaqu密度梯度离心法.freelin，离心20min后收集单个核细胞.调节细胞浓度为106/mL,然后在6孔板上贴壁,每孔加2mL,3h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，加入Ⅰ号营养液:100mL/L小牛血清RPMI1640中含GMCSF50ng/mL,IL41
3、0ng/mL,在37℃，50mL/LCO2孵箱中培养,每日半量换液1次,.freelL/L小牛血清RPMI1640中含GMCSF50ng/mL,IL410ng/mL,TNFα20ng/mL,仍每日半量换液1次.细胞培养至10d左右收集，FITC标记的CD83,CD40,HLADR,CD86,标记DC并用流式细胞仪检测，并拍摄细胞照片.2结果树突状细胞的光镜下形态：树突状细胞比淋巴细胞大,直径在10～20μm之间,有许多刺状突起,分布于细胞表面(图1).培养10d后,流式细胞仪分析,其中CD830.92,CD400.3
4、0,HLADR0.90,CD860.90.3讨论树突状细胞是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcells,APC)，能摄取加工和提呈抗原.DC表达高水平MHCⅠ,MHCⅡ类分子，共刺激分子和粘附分子,能够显著刺激初始型T细胞(NaiveTcells)增殖,A:×400;B:×200.启动T细胞介导的免疫反应.DC在免疫学、肿瘤学及其他各学科的作用日益受到重视［1］.目前作为治疗用的DC主要来源于骨髓与外周血,通过骨髓(主要为CD34+)或外周血中(主要为CD14+)的造血干细胞.
5、但外周血中的造血干细胞比骨髓中更少,其培养难度也高,必须用最佳的细胞因子进行诱导.培养DC的细胞因子组合有多种方案,其中主要有GMCSF,IL4，TNFα等［2,3］,在DC培养基中仅加入GMCSF和IL4,只能培养出不成熟的DC,只有加入另外的一种或多种细胞因子如TNFα,IFNγ等方可诱导产生成熟的DC［4,5］.本文选用GMCSF,IL4,TNFα这一细胞因子组合,因为GMCSF可促进DC增殖，IL4则可抑制巨噬细胞增生而利于干细胞向DC分化,TNFα可促进DC成熟.本研究发现如果每天进行半量换液则细胞状态较隔
6、天半量换液为好，有利于对DC进行进一步的处理.目前鉴定DC仍然要靠细胞形态和细胞表面共刺激分子等来综合鉴定DC.对DC表面分子有必要作进一步的研究以寻求DC特异性标记,为DC用于临床免疫治疗奠定基础.【
