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1、丹曲林钠对类缺血小鼠皮质神经元的［Ca2+］i和细胞活力的影响论文高军宪，万琪，田晔，李力，刘勇红【关键词】,钙离子【Abstract】AIM:Tostudythechangesofintracellular［Ca2+］andcellactivityincorticalneuronsfolloiclikeconditioningandtoexploretheprotectiveeffectsofdantroleneontheneurons.METHODS:Neuronseasuredbyfluorescentintensity(FI)ineachcellicrosco
2、pyandthedegreeofinjuredneuronsinischemiclikeconditioning,arapidincreaseinfluorescenceintensityicgroupandtherapygroup(P0.05).TheAvalueofinjuredneuronsinischemicgroupiclikeconditioning.【Key;ischemiclike;dantrolene【摘要】目的：观察类缺血后神经元内钙离子浓度及细胞活性的变化,探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及丹曲林钠（Dantrolene）的作用.方法：
3、采用孕小鼠皮层神经元培养技术，应用相差显微镜观察培养的神经元形态，激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度.结果：给予神经元类缺血处理5min后,神经元内钙离子浓度与丹曲林钠组无显著差异(P0.05).类缺血处理10min后再灌注15min细胞损伤程度较丹曲林钠干预组［Ca2+］i和MTT有显著性差异(P0.01).结论：丹曲林钠可抑制神经元细胞内钙离子浓度的升高,降低缺血性神经元损伤的程度.【关键词】钙离子；类缺血；丹曲林钠0引言神经元对缺血、缺氧十分敏感，即使时间很短也会造成不可逆损伤.freelm塑料培养皿中央钻一直径10mm的圆孔，将18mm×18mm盖玻片用
4、加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用.1.2.2配制人工脑脊液其组成为（mmolL-1）：NaCl123,KCl3.75,KH2PO41.25,NaHCO326,MgCl21,CaCl22,葡萄糖10，pH=7.4.1.2.3细胞培养取孕15d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死,.freelin),静置2~3min弃上清,200gL-1胎牛血清的DMEM终止消化5~8min,以完全培养基(100mLL-1胎牛血清,青、链霉素1×1011UL-1)稀释至7×108L-1密度并接种于经多聚赖氨酸(Sigma)处理过的专用培养皿和96孔板(细胞接种1×105/孔),送入含50mLL-1
5、CO2和950mLL-1O2的培养箱(Sanyo公司),37℃,培养48h后,加入阿糖胞苷(5mgL-1)以抑制非神经元的继续生长,每隔2d半量换液,培养10d后,可见典型的神经元细胞，经βtubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养［3］.1.2.4类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液ngACSF，温度保持在(30±2)℃，混合气体换为920mLL-1N2/80mLL-1CO2.1.2.5实验分组缺血组(对照组)：按类缺血模型处理5和10min.实验组：给予30μmolL-1丹曲林钠（Sigma公司）孵育10~15min后，类缺
6、血处理5和10min.同时对照组及实验组均分为有钙ngACSF和无钙ngACSF2组.每组取n=8个细胞测其△FI作为观察结果.1.2.6神经元细胞［Ca2+］i的浓度测定将培养皿内培养的细胞经磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次，于37℃条件下用Fluo3/Am(终浓度10μmolL-1,BioRad公司)负载30min,PBS冲洗3次，将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化（Fig1），激发波长488nm,发射波长522nm，采样频率为488Hz,共聚焦系统由BioRad公司MRC1024提供的TimeCourse/Ratiom
7、etric软件控制，每皿选2~3个视野，以平均荧光强度变化（FI）反映胞内游离钙离子浓度的相对水平［4］.1.2.7MTT测定向96孔板每孔加入MTT（华美公司，1.5gL-1）20μL,37℃继续培养4h，吸弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪测各孔A490nm值.统计学处理：数据经Pentrium90微机系统TimeCourse/Ratiometric软件对图形及时间进行实时测量获得.采用Origin6.0统计软件进行数据处理，以x±s表示，组间比较采用方差分析.2结果2.1丹曲林钠
