小剂量环孢素a治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中nfat活性及gmcsf表达的影响论文

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1、小剂量环孢素A治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中NFAT活性及GMCSF表达的影响论文杨玉捷惠玲郭艳芳张红霞杨伟捷葛勤利张方信【摘要】目的：研究小剂量环孢素A(CsA)治疗的溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜中核转录因子(NFAT)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的变化，及其对黏膜炎症的影响.方法:UC患者14例经CsA治疗，采用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测肠黏膜NFAT治疗前后活性的变化，半定量RTPCR法检测肠黏膜中GMCSFmRNA的改变，治疗前后对肠黏膜炎症程度进行评估.结果:UC患者治疗后肠黏膜

2、NFAT活性下降(0.80±0.31vs0.50±0.20,P0.05),GMCSFmRNA表达也有降低（1.09±0.07vs0.49±0.03,P0.01）,肠黏膜炎症程度也下降（P0.05）.结论:小剂量CsA治疗UC有效,其机制与调控NFAT的转录活性有关，并进一步降低激活因子GMCSF的表达.【关键词】结肠炎溃疡性环孢素A核转录因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子0引言溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）为一种肠道非特异性炎症，它的传统治疗包括激素、5氨基柳酸、硫唑嘌呤(AZA)或6巯嘌呤(6M

3、P)等，超过60%的重度UC患者活动期需糖皮质激素治疗.freelg/kg,用药7d，病情缓解者改每日口服CsA5mg/kg，分2次口服.每位患者CsA治疗前后各取50mg活检组织，并立即贮存在液氮中备用.1.2方法1.2.1NFAT测定肠黏膜核蛋白提取参照Cui等［6］方法.溶液A(mmol/L):HEPES10（pH7.9），KCl10，DTT1.0，EDTA0.1，EGTA0.1;溶液B(mmol/L):HEPES20（pH7.9），KCl0.4，DTT1.0，EDTA0.1，EGTA0.1;溶液C：PMSF10μmo

4、l/L，肽胺5mg/L，抑酶醛肽5mg/L，抑肽酶5mg/L.冷冻组织50mg放入匀浆器中研磨后，加入溶液Ａ400μL置冰上15min，加入100g/LNP4025μL，置震荡器上强烈震荡30s，1200r/min低温离心20min，弃上清，用溶液B100μL重悬沉淀，4℃震荡45min，1200r/min低温离心5min，收集上清即为核蛋白提取物，-70℃保存.G250法测定蛋白质含量，波长595nm.寡核苷酸探针（序列为5′AGCTGAAAGGAGGAAAGCAAGAGTCATA3′，其中含有人类GMCSF启动

5、子序列［7］，北京亚辉生物医学工程公司），标记［γ32P］dATP（北京亚辉生物医学工程公司），按试剂盒说明方法进行.置-20℃保存.所有样本核蛋白定量为5μg，在总反应体系20μL中根据蛋白浓度调整蛋白体积，使蛋白与三蒸水的总体积为10μL，再加入Tris.Cl0.2mol/L,NaCl1mol/L,EDTA10mmol/L,MgCl20mmol/L,DTT10mmol/L,polydI/dC2g/L（Sigma公司）各1μL，250mL/L甘油3μL，置冰上20min后，加入标记探针1μL.电泳对照组蛋白与三蒸水的总体

6、积为9μL，需加10pmol/L的未标记探针1μL.10×TBE缓冲液5mL，300g/L丙烯酰胺10mL，100g/L过硫酸胺0.3mL，TEMED30μL，双蒸水35mL，混匀，灌胶，待胶凝固后，上样，用BioRad垂直电泳仪，电压30V电泳2h.在干胶仪上干胶40min，置入暗盒中，覆盖2张胶片，-70℃低温冰箱过夜，冲洗胶片.BioRadModel583GelDryer干胶仪，CurixHT330U（AGFA产品）胶片自动冲洗仪.每条带的放射信号强度采用BAS2000phosphorimageanalyzer(

7、FujiFilm,Minamiashigara,Japan)分析仪计数.各实验组均作3次重复实验.1.2.2GMCSF测定GAPDH上游引物：5′CTGGCGCTGAGTACGTCGTG3′,下游引物：5′CAGTCTTCTGGGTGGCAGTG3′,294bp,29个循环；GMCSF上游引物：5′TGCAGAGCCTGCTGCTCTTG3′,下游引物：5′CAAGCAGAAAGTCCTTCAGG3′，400bp,30个循环［8］.RTPCR方法：细胞总RNA的提取按RNA提取试剂盒Trizol(Gib

8、co公司)说明书进行，RNA沉淀溶1g/LDEPC水中，采用紫外分光光度计测RNA浓度.A260nm/A280nm比值需在1.8～2.0，并稀释至1g/L.在逆转录体系20μL中加入模板RNA1μL，总RNA达0.1～1.0μg，Oligo(dT)18(0.2g/L)4μL，用DEPC处理