大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性变化

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1、大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性变化作者：卓莉蔡广研刘伏友傅博【摘要】目的观察大鼠肾小球系膜细胞随增龄细胞表型及功能的变化特点。方法取3、12、24月龄健康雄性TT法检测细胞增殖能力，进行SAβgal染色，采用RTPCR和TT）法检测细胞增殖能力系膜细胞生长至80％融合，0.25％胰酶消化，计数后接种于96孔板，2000个细胞/孔，细胞贴壁后，继续培养24、48、72、96、120h，加入MTT(5mg/ml)10μl孵育4h后，加二甲基亚矾（DMSO）200μl/孔裂解细胞，避光10min，于492nm波长记录吸光度值。　　1.3衰老相关半乳糖苷酶活

2、性（SAβgal）染色接种于6孔板中的各组细胞，待细胞生长至80％汇合，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，于室温固定细胞5min，PBS液清洗3次后，加上新配制的含1mg/ml5溴4吲哚βD半乳糖苷（Xgal）（美国Progrma公司）的SAβgal染液，置37℃（无CO2）温育12～16h，PBS液清洗3次后，观察细胞胞浆中蓝色沉淀，用数码相机拍照。　　1.4RNA提取及反转录聚合酶链反应（RTPCR）分析利用Trizol一步法提取肾小球系膜细胞总RNA，进行RTPCR。采用的引物序列如下：p212200凝胶图像分析系统(美国Al

3、pha公司)，进行半定量分析。　　1.5蛋白质提取及icroBCAProteinKit测蛋白浓度。取100μg总蛋白，加2×十二烷基磷酸钠（SDS）上样缓冲液，100℃变性5min。进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离，将胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭4h，加p21in，PBS洗3遍，冰上透化10min，PBS洗3遍，1％牛血清白蛋白（BSA）冰上封闭10min，p21WAF1/CIP1/SDI1小鼠单克隆抗体，37℃孵育1h，4℃过夜，含吐温20的TBST洗10遍，TRITC标记的山羊抗小鼠IgG，避光室温孵

4、育1h，TBST洗10遍，荧光显微镜下照相。　　1.7统计学处理使用SPSS11.0软件进行统计分析，计量资料使用x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。　　2结果　　2.1不同月龄大鼠原代系膜细胞生长及表型特征3、12及24月龄大鼠的原代系膜细胞均为长梭形或不规则星形，贴壁后生长迅速，约3～4d后可传第1代。传代后，3、12月龄大鼠的系膜细胞仍保持旺盛的增殖能力，约2～3d传1代，3月龄大鼠系膜细胞可传20代左右；而12月龄大鼠系膜细胞可传10代以上。24月龄大鼠的系膜细胞生长速度明显较3及12月龄大鼠系膜细胞减慢，约5～7d才可传1代，群体倍增时间

5、较前者系膜细胞延长1倍以上。而且传至第2～3代后，细胞肥大，形态变扁平、伸展，代谢减慢、生长停滞，失去增殖和传代能力。　　2.2不同月龄大鼠原代系膜细胞增殖能力MTT法检测结果显示，24月龄大鼠系膜细胞72，96及120h的OD值（0.314±0.05，0.385±0.06及0.456±0.08）显著低于3月龄大鼠系膜细胞（0.430±0.03，0.556±0.04及0.671±0.05）及12月龄大鼠系膜细胞（0.425±0.04，0.543±0.05及0.657±0.06）相应时间点的OD值（P＜0.05）；3月龄与12月龄间比较无统计学差异(P＞0.

6、05)。　　2.3不同月龄大鼠原代系膜细胞SAβgal染色结果显示，3月龄大鼠的系膜细胞染色阳性率很低，仅为(11.9±3.6)%，系膜细胞SAβgal染色阳性率随增龄逐渐增高，12月龄组为(39.0±4.0)%，而24月龄组细胞阳性率高达(86.9±7.4)%。3组间两两相比，差异有统计学意义（均P<0.05），表明大鼠的系膜细胞在机体内确实随年龄增长而发生衰老。　　2.4RTPCR检测原代系膜细胞p21aLJ，TangZ，etal.Dootesapoptosisinsenescenthumanfibroblasts：involvemen

7、tofretinoblastomaprotEinphosphorylationanddelayofcellularaging〔J〕.JCellPhysiol，2004；201(3):48391.