P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义

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1、http://www.paper.edu.cn△P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义*柳飞，唐万欣，黄颂敏四川大学华西医院肾内科，四川成都610041摘要：目的：探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组：正常对照组，高糖组，甘露醇组，不同浓度胰岛素组，高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光（FSC）大小。结果：正常对照组系膜细胞中P21m

2、RNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(p<0.01)；FSC为正常对照组的1.42倍(p<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加，但无统计学意义（p>0.05）。结论：(1)P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2)高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调，且与渗透压无明显关系。(3)P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。关键词：糖尿病肾病细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21细胞肥大糖尿病肾病（Diabeti

3、cNephropathy,DN）是糠尿病主要的微血管并发症之一。在西方发达国家，DN已成为终末期肾功衰（End-stageRenalFailure,ESRD）的首位病因。在我国，随着糖尿病的逐渐增加，糖尿病肾病也呈上升趋势。因此，深入研究DN的发病机制，制定更加有效的防治措施已成为肾脏病工作者面临的重要问题。DN的发病机制尚未完全阐明，一般认为是多种因素共同作用的结果。DN早期即出现肾小球高滤过以及肾小球肥大。肾小球肥大可导致肾脏结构不可逆的变化，如肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致终末期肾功衰。近年来的研究证实各种因素对细胞生长的影响[

4、1]最终发生在细胞周期水平。细胞周期调控依赖于一系列细胞周期调控蛋白。其中，P21是目前已知的具最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。P21的过度表达与许多细胞增殖[2-4]抑制和肥大有关。有研究表明，糖尿病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P21蛋白表达增加[5]有关。而系膜细胞肥大在早期肾小球肥大中起关键作用，这已在糖尿病患者和糖尿病大鼠[6、7]动物模型研究中得到证实。P21在肾小球系膜细胞肥大中发挥什么作用，目前国内外研究甚少。本研究采用半定量RT-PCR法，观察高糖刺激，不同浓度胰岛素作用下，鼠1097系膜细胞中P21mRNA的表达及

5、其变化。相应条件下，用流式细胞仪测量细胞前向角散射光大小，从而获得系膜细胞体积大小，从细胞分子水平探讨高糖、胰岛素干预下，P21在系膜细胞肥大-肾小球肥大的关系，为DN的防治寻求新的治疗靶。1材料和方法*通讯作者△教育部博士点基金资助项目，编号200206100781http://www.paper.edu.cn1.1试剂：RPMI1640培养基由美国GIBCO公司提供，小牛血清由成都哈里生物有限公司提供，TrizolRNA提取液和TitanTMonetubeRT-PCR试剂盒由大连宝生物有限公司提供。1.2细胞来源及分组大鼠1097系膜细胞

6、株来源于中山医科大学附一院肾脏病临床研究重点实验室。本实验所用细胞为5-7代。将系膜细胞分为8组：正常对照组，生理浓度胰岛素-9-8-6组（10MIns），低浓度胰岛素组（10MIns），高浓度胰岛素组（10MIns），高糖组（30mM-9D-Glu），甘露醇组，高糖加生理浓度胰岛素组（30mMD-Glu+10MIns），高糖加高浓度胰岛-6素组(30mMD-Glu+10MIns)。每组设3复孔。1.3细胞干预因素1.3.1铺板。将系膜细胞用0.25%胰酶消化液消化，10%FCS1640培养液终止消化。镜下计数55细胞，配成1×10/ml细胞

7、悬液，接种于6孔平底培养板，2m1/孔，细胞密度1×10/ml，置CO2培养箱中培养。1.3.2同步。培养24h，吸弃上清液，加入1640培养液，置CO2培养箱培养24h，使细胞同步于G0期。1.3.3加干预因素。吸弃六孔板中上清液，将培养的5-7代系膜细胞按前述实验分组分为8组加入干预因素，2ml/孔，作用72小时，每24小时换液一次。1.4细胞内总RNA提取干预因素作用72h后，吸弃6孔板中上清液，用PBS洗涤各组细胞。每孔加入1mlTrizolRNA提取液，提取各组细胞RNA，用紫外分光光度计测260mm的紫外吸收值，重复测三次，根据O

8、D260值计算RNA浓度。[7]1.5逆转录一多聚酶链反应（RT-PCR）根据文献合成P21和β-actin寡核苷酸引物。β-actin:上游5′-AACCGGGA