反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量

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1、反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量作者：廖晓慧孙海燕刘冬彭光华张声华【摘要】目的建立反相高效液相色谱（RPHPLC）测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的方法，为其深入研究提供方法学基础。方法采用AydacC18反相柱（4.6mm×250mm,5μm），Aydac保护柱，柱温30℃，以乙腈∶水(22∶78)，0.05%TFA为流动相，流速1.0ml/min，检测波长215nm，参考波长350nm，进样量20μl。结果该方法使降血压肽与其它相似产物得到较好分离，在5～250μg/ml内线性关系良好，r=0.9998，最低检测限达8ng，低、中、高浓度下的加样回收

2、率、日内、日间精密度均符合方法学要求。结论该方法稳定、灵敏度高、操作简便、适用于重组降血压肽的含量测定。【关键词】重组大肠杆菌；降血压肽；反相高效液相色谱　　Abstract：ObjectiveAsimpleandrapidreversed-phasehighperformanceliquidchromatographicmethodentationbroth.MethodsTheseparationconditionsn,Aydacguardcolumn.Mobilephasel/min.Thedetection,reference.Columntemperaturee：20μ

3、l.ResultsAHPhasgoodseparationfromotherponentsinfermentationbroth.Andtherel,r=0.9998.Thelimitofdetectionetthemethodologyrequirements.ConclusionThismethodhadhighprecision,highaccuracyandanipulated.ThismethodprovedtobesuitableforAHP.　　Keym×250mm，5μm），美国Aydac公司；保护柱（guardcolumn），美国Aydac公司；高速离心机Cen

4、trifuge5810R，德国eppendorf公司；一次性针头式过滤器0.45μm，美国millipore公司。　　1.2试剂降血压肽标准品由上海华大天源生物科技有限公司按LysValLeuProValPro氨基酸序列合成，纯度≥95%；发酵样品由深圳市发酵精制重点实验室制备；乙腈HPLC级，天津协和昊鹏色谱科技有限公司；三氟乙酸（TFA）HPLC级，美国sigma公司。实验用水均为18.2Ω超纯水。　　2方法　　2.1标准储备液的配制精密称取0.0200g标准品，溶于超纯水中，定容至10ml容量瓶中，即得2mg/ml标准储备液。　　2.2发酵样品的处理发酵液经离心，

5、收集菌体细胞，破碎，亲和层析，酶切等分离、纯化过程而得，经0.45μm滤膜过滤，HPLC进样。　　2.3色谱条件色谱柱：AydacC18反相柱（4.6mm×250mm，5μm），Aydac保护柱；流动相：乙腈∶水(22∶78)，0.05%TFA；流速：1.0ml/min；检测波长：215nm，参考波长350nm；柱温：30℃；进样量：20μl。　　2.4标准曲线的制定取2.1项下配制的标准储备液分别稀释成250，100，50，20，10，5μg/ml标准溶液，0.45μm滤膜过滤，20μl进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归。　　2.5精密度实验　　2.5.1日内精密度取100，

6、50，20μg/ml的标准溶液，1d内分别连续进样6次，计算RSD（%）。　　2.5.2日间精密度取100，50，20μg/ml的标准溶液，分别于6d进样（n=3），计算RSD（%）。　　2.6回收率实验采用标样添加法，取100，50，20μg/ml3个浓度的发酵液分别添加浓度为50μg/ml的标准液至理论值分别为150，100，70μg/ml进样测定，测定峰面积，计算回收率。　　3结果　　3.1色谱行为考察本实验选择水加乙腈作流动相，TFA作阴离子对试剂，针对不同的乙腈和TFA浓度及洗脱速度对降血压肽的洗脱峰形、分离效果进行研究。研究表明，影响分离度的因素主次依次为乙腈浓度&g

7、t;TFA浓度>洗脱速度。从相邻峰的分离度和缩短分析时间综合考虑，最终优化条件为乙腈浓度22%，TFA0.05%，洗脱速度1ml/min。AHP的保留时间为4.15～4.20min之间。标准品与样品的色谱图如图1～2。　　图1降血压肽标准品色谱图（略）　　图2发酵样品中的降血压肽色谱图（略）　　3.2线性考察及最低检测限以250，100，50，20，10，5μg/ml为标准系列溶液，0.45μm滤膜过滤，20μl进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得标准曲线如图3。实验表