fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素（msh）的工艺研究

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1、Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素（MSH）的工艺研究【关键词】固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基　　【Abstract】AIM:Tostudytheprocessandinfluencingfactorsofsynthesizingthemelanocytestimulatinghormone（MSH）peptidebyFmocsolidphasesynthesis.METHODS:SH,anditsfitforthelargescaleproduction.　　【Keyoc　　【摘要】目的：研究9芴甲

2、氧羰基（Fmoc）固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)工艺的步骤及其影响因素.方法：采用Fmoc保护α氨基，以TBTU/HOBT/DIEA为缩合剂合成MSH.用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定.结果：多肽合成的得率可达63%，经反相高效液相色谱仪（RPHPLC）对合成的多肽进行纯化后可得纯度为98.67%的目标肽.通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS）检测所合成多肽的分子质量为1663.88ku，与其理论分子质量1664.08ku相符.结论：该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽M

3、SH的特点，适合大批量生产.　　【关键词】固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基　　0引言　　多肽作为生物体内的重要组成部分之一，在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性［1］.黑色素细胞刺激素(MSH)是由13个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽，可抑制发热与主要类型的实验性炎症.固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽MSH中具有快速、简便、高效等优点［2］，但需要对不参与反应的氨基加以保护，同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护.保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应，又要保证在肽链合成过程中不

4、受破坏，同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去［3］.国内外经常采用叔甲氧基（Boc）保护α氨基，却难以合成对酸不稳定的多肽.由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸，对酸不稳定.我们旨在采用9芴甲氧羰基（Fmoc）基团保护α氨基以合成MSH.　　1材料和方法　　1.1材料RPHPLC型高效液相色谱仪(Beckman公司);基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS，Heoc保护的氨基酸（Merck公司）；1羟基苯并三氮唑（HOBT），1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU,ABI公司）；二异丙基乙

5、胺（DIEA），三氟乙酸（TFA,Sigma公司）；乙腈（Fisher公司）；NN二甲基甲酰胺（DMF），二氯甲烷（DCM），异丙醇，FmocRinkAmideMBHAResin［吉尔生化（上海）有限公司］.　　1.2方法　　1.2.1树脂的选择根据导入反应基团的不同，可以把树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等［4］.本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要选用一种Rink氨基树脂即RinkAmideMBHAResin，在RinkAmideMBHAResin中加入缩合剂TBTU/H

6、OBT/DIEA使MSH的Val与树脂之间形成酰胺键，以此来完成氨基酸的固定.　　1.2.2FmocValOH与FmocRinkAmideMBHAResin的连接根据合成多肽的序列，将RinkAmideMBHAResin置于已用DCM浸泡过的反应器中，加入DMF浸泡30min左右，使其充分膨胀，然后用含200mL/L哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，再用异丙醇洗涤树脂2次，最后用DMF洗涤树脂3次，当用50g/L茚三酮检测呈阳性时将FmocValOH，TBTU，HOBT,DIEA及DMF配成的反应液加

7、入到树脂中，室温下反应1.5h，当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF溶液各洗涤2次.即完成第1个氨基酸与树脂的连接.　　1.2.3接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的TBTU/HOBT/DIEA的混合液［5］,反应时间约为1.5h，每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测，若呈阳性说明反应不完全，继续加入缩合剂，使其充分反应.若呈阴性说明反应完全，用含200mL/L哌啶的DMF溶液脱除新接入氨基酸的Fmoc基团以便于下一个氨基酸的羧基反应.重复此过程至MSH中所有氨基酸

8、全部接入.　　1.2.4MSH－树脂的切割MSH合成完毕后，用N2吹干MSH树脂，将其置于反应器中，加入切割试剂（10mLTFA，0.5mL苯甲硫醚，0.25mL巯基乙醇，0.5mL水，0.75g苯酚），室温下磁力搅拌反应3h左右，使MSH与树脂分离，再经砂芯过滤，将滤液加入冰乙醚中析出多肽，最后经离心分离获得MSH粗品.　　1.2.5MSH的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保