脆性x智力低下基因fmr1中不稳定dna序列的研究-论文

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1、脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列的研究*论文.freelentallyretardantFMR1geneoffragileX【Abstract】ObjectiveTodetectthepolymorphismofCGGrepeatslocatedinthementallyretardantFMR1geneoffragileX.MethodsTodetectandtestthepolymorphismandfrequencyofCGGrepeatslocatedintheFRAXAregionefrom299chromosomeofnorm

2、alhunanpupulations.ResultsThenormalrangeofCGGrepeatsis20-40，themeannumberis28，thedatashoeasthoseofPCR-Southernblot.ConclusionRealizethepolymorphismofCGGrepeatslocatedintheFRAXAlocus;2.ThePCR-Sequencegelsilverstainingorerapid，immediate，simpleandeconomy，eonalargescale.【KeyeFMR1CG

3、GrepeatsPCR脆性X综合征（fragileXsyndrome，FraX）是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000［1］，女性的发病率为1/2500［2］。其在细胞学上主要表现为Xq27.3带处有一细丝样的脆性位点（FRAXA）［3］，在分子水平上表现为FMR1基因5’端（CGG）n的异常扩增。（CGG）n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n＞200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化［4］。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG

4、重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。1材料和方法1.1研究对象及标本208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。1.2主要试剂T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所NanbertZhong博士惠赠。1.3PCR扩增PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1

5、基因内（CGG）n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5’-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3’，下游引物为：5’-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1UTaqDNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。1.4PCR产物的序列胶银染

6、法检测取10μlPCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、AgNO3溶液染色及Na2CO3显示后观察结果。1.5Southern印迹杂交取5μlPCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ-32P-ATP标记探针PE5.1，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。2结果2.1湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性及分布频率用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定（图2），Southern印迹杂交法验证（图3），表明（CGG）n的拷贝数在20～40之间(见表1)，频率最高的为28

7、（图1）。图1299条X染色体的(CGG)n多态性分布图表1湖南省人群中299条X染色体的CGG重复数2.26%序列胶电泳检测PCR产物见图2。图26%序列胶电泳2.3Southernblot检测PCR产物Southern印迹杂交结果显示PCR扩增产物区带所在位置与图2完全一致(见图3)。图3Southern印迹杂交3讨论3.1湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性299条M:PBR322/MSPI;1，2，3，4，5，6分别表示CGG重复数为28，28，31，28，28，29第1，6道为正常女性，第2，3，4，5道为正常男性(下同)。表型正

8、常的湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n测定结果显示，其拷贝数范围为20～40，高峰为28，占被检总