脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列的研究-

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1、脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列的研究*李斌元，马云，何淑雅，钟南，孙春莉，闵凌峰关键词：脆性X综合征【摘要】目的检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中n拷贝数的多态性。方法采用PCR结合序列胶银染法、Southernblot杂交分析法，对299条表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点n拷贝数的多态性及分布频率进行了测定和验证。结果显示其范围为20～40，高峰为2，PCR-序列分析银染法结果与Southernblot法结果完全一致。结论检测了湖南省人群X染色体FRAXA位点n拷贝数的多态性；运

2、用PCR-序列分析胶银染法快速、直接、简便、实用，适合脆性X综合征的大规模群体筛查。【关键词】脆性X综合征FMR1nPCRThestudyoftheunsteadyDNArepeatlocatedinthementallyretardantFMR1geneoffragileX【Abstract】ObjectiveTodetectthepolymorphismofCGGrepeatslocatedinthementallyretardantFMR1geneoffragileX.MethodsTodetectandte

3、stthepolymorphismandfrequencyofCGGrepeatslocatedintheFRAXAregioncomefrom9chromosomeofnormalhunanpupulations.ResultsThenormalrangeofCGGrepeatsis0-40，themeannumberis8，thedatashowedthattheresultsofPCR-sequencegelsilverstainingwasthesameasthoseofPCR-Southernblot.C

4、onclusionRealizethepolymorphismofCGGrepeatslocatedintheFRAXAlocus;2.ThePCR-Sequencegelsilverstainingwasmorerapid，immediate，simpleandeconomy，whichsuitstothecolonyscreeningfragileXsyndromeonalargescale.【Keywords】fragileXsyndromeFMR1CGGrepeatsPCR脆性X综合征是常见的遗传性智力低下

5、性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000［1］，女性的发病率为1/2500［2］。其在细胞学上主要表现为带处有一细丝样的脆性位点［3］，在分子水平上表现为FMR1基因5’端n的异常扩增。n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n＞200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化［4］。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。1材料和方法研究对象及标本08名人群为本校附属

6、医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。主要试剂T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针由美国纽约州立发育不全基础研究所NanbertZhong博士惠赠。PCR扩增PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1基因内n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5’-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-

7、3’，下游引物为：5’-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1UTaqDNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物的序列胶银染法检测取10μlPCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、AgNO3溶液染色

8、及Na2CO3显示后观察结果。Southern印迹杂交取5μlPCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ-32P-ATP标记探针，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。2结果.1湖南省人群中FRAXA位点n的多态性及分布频率用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定，Southern印迹杂交法验证，表明n的拷